热淋清颗粒的体内代谢动力学研究

摘要

“热淋清颗粒”为对泌尿系统有独特疗效的苗药单方制剂,70年代经卫生部批准生产并列入贵州省地方标准(黔 D/WS-299-89),1998年收载于中华人民共和国中药成方制剂,2002年进入国家基本药物目录,2004年进入国家基本医疗保险目录,已被遴选为国家中药保护品种、国家社保药物,并为唯一进入2010版《中国药典》的苗药,获国家发改委单独定价权。其在2010版《中国药典》中记载的功能主治为:清热泻火,利尿通淋,用于下焦湿热所致的热淋,证见尿频、尿急、尿痛;尿路感染、肾盂肾炎见上述证候者。经过多年的应用,热淋清颗粒以其稳定的疗效、较高的安全性、可靠的质量得到广大医生和患者的好评,享有很好的声誉。
　　然而,热淋清颗粒用于治疗泌尿系统感染、肾盂肾炎、膀胱炎、尿路结石等疾病的药效物质基础不明确,对其作用机制、生物转化和体内代谢过程的研究无的放矢。研究发现热淋清颗粒及其原料药材(头花蓼药材)富含酚酸类、黄酮类化合物,具有良好的抗氧化、抗炎、抗病毒、杀菌等生物活性作用。但热淋清颗粒中所含酚酸类、黄酮类化合物是否为其吸收入血并参与血液循环的“有效成分”,是否为其发生药效的“物质基础”尚不清楚。因而开展口服热淋清颗粒后含药血清中的移行成分分析,对其入血成分的吸收、分布、代谢及排泄特征进行系统阐明,确定其在体内的变化过程,研究其药效相关性,具有重要意义。
　　没食子酸(Gallic Acid,GA)和原儿茶酸(Protocatechuic Acid,PCA)为热淋清颗粒中的含量较大的成分,2010版《中国药典》中更是以GA的含量为指标来控制热淋清颗粒的质量(不少于23.0 mg每袋),且研究表明 GA和 PCA的单体成分均可被吸收入血,通过参与血液循环发生作用。因此本研究以 GA和 PCA为指标,探究了口服热淋清颗粒后,GA和 PCA在大鼠体内的药代动力学过程,为热淋清颗粒作用机制的阐明提供科学数据。研究如下:
　　一、口服热淋清颗粒后 GA和 PCA血浆药代动力学研究
　　本研究建立了灵敏、快速、高特异性的同时测定大鼠血浆中 GA、PCA两种活性成分的 LC-MS/MS方法,血浆样品经蛋白沉淀、离心后,上清液经Phenomenex C18色谱柱分离进行质谱测定,质谱仪为三重四级杆串联质谱,ESI离子源,负离子扫描,多反应监测(Multiple reaction monitoring(MRM))模式检测GA、PCA和岩白菜素内标(internal standard, IS)用于定量分析的离子对分别为169.181→125.268(GA)、152.918→109.244(PCA)和326.922→192.167(IS)。对该定量分析方法进行了系统完整的方法学验证,对 LLOQ、线性、专属性、精密度、准确度、回收率、稳定性等进行了考察,结果显示各项指标均符合生物样品分析方法指导原则的有关规定,该方法可以用于测定大鼠血浆中 GA和 PCA的含量。
　　利用该方法对不同剂量灌胃给药(0.36、1.08和2.16 g·kg-1)热淋清颗粒后 GA和 PCA在大鼠血浆药代动力学进行研究,通过测定血浆不同时间点 GA和 PCA的浓度,采用数理统计学软件计算了灌胃给药热淋清颗粒后的药代动力学参数。
　　灌胃热淋清颗粒后,低、中、高三个剂量组 GA的 t1/2分别为128.52、93.72和114.70 min;Cmax分别为245.98、477.20和805.76 ng·mL-1; AUC0-∞分别为53776.77、97385.52、204204.47μg·L-1·min-1;在0.36~2.16g·kg-1的剂量范围内,GA在大鼠体内呈现线性药代动力学特征(γ>0.98)。
　　灌胃热淋清颗粒后,低、中、高三个剂量组 PCA的 t1/2分别为42.81、90.15和49.80 min;Cmax分别为11.90、24.66和31.04ng·mL-1;AUC0-∞分别为943.88、2943.38、4222.79μg·L-1·min-1;在0.36~2.16g·kg-1的剂量范围内,PCA在大鼠体内呈现线性药代动力学特征(γ>0.90)。
　　二、口服热淋清颗粒后 GA和 PCA的组织分布研究
　　建立并验证了 LC-MS/MS法测定大鼠各组织中 GA和 PCA含量的方法,方法学验证结果表明,该方法操作方便,灵敏度高,专属性好;准确度、精密度、回收率和稳定性考察结果均符合目前生物样品分析方法指导原则的有关规定。利用该方法对灌胃热淋清颗粒(1.08 g·kg-1)后 GA和 PCA在大鼠各组织,包括心、肝、脾、肺、肾、脑等组织的分布情况进行研究,结果表明:灌胃给药1 h后,GA主要分布在肾脏组织,其次为肺、肝组织,浓度分别为1218.62、258.08和231.55 ng·g-1;PCA主要分布在肾脏组织,其次为肺脏组织,浓度分别为43.98和19.48 ng·g-1。灌胃给药3 h后,除肾脏组织中检测到GA(143.54ng·g-1)外,其余组织均未检出 GA和 PCA。灌胃热淋清颗粒后 GA和 PCA在肾脏组织中集中分布与其临床治疗尿路感染和肾盂肾炎的用途相符合。
　　三、口服热淋清颗粒后 GA和 PCA的排泄研究
　　分别建立并验证了 LC-MS/MS法测定大鼠尿液和粪便中 GA和PCA含量的方法,方法学验证结果表明,所建立方法操作简便,灵敏度高、专属性好,利用该方法对灌胃热淋清颗粒后 GA和 PCA在大鼠尿液和粪便中的排泄情况进行了研究。
　　灌胃热淋清颗粒后,0.36、1.08、2.16g·kg-1三个剂量组GA在48 h内尿液中的排出量分别为108.80、361.44和950.38μg;排泄率分别为13.19、14.60和19.20％;GA在48 h内粪便中的排出量分别为21.25、93.16、192.10μg;排泄率分别为2.58、3.76和3.88%;总排泄率均<23.08%,显示 GA在大鼠体内发生了较广泛的代谢。
　　灌胃热淋清颗粒后,0.36、1.08、2.16 g·kg-1三个剂量组 PCA在48 h内尿液中的排出量分别为6.76、29.55和60.69μg;排泄率分别为10.79、12.57和16.15%;PCA在48 h内粪便中的排出量分别为3.56、6.74、12.19μg;排泄率分别为5.68、3.59和3.24%;总的排泄率均<19.39%,显示 PCA在大鼠体内也发生了较广泛的代谢。
　　四、头花蓼药材提取工艺优化研究
　　研究发现,头花蓼药材中富含黄酮类成分,且黄酮类化合物具有较强的生物活性,但头花蓼的水提物中,黄酮类成分的提取效率不高,造成资源植物的浪费。因此,本实验通过采用单因素结合响应曲面法对头花蓼药材中槲皮苷(quercitrin)和总黄酮(total flavonoids, TF)的最佳提取工艺进行了研究。根据中心组合设计原理,建立头花蓼药材中槲皮苷及总黄酮提取率与溶剂浓度、料液比及提取时间的二次多项式数学模型,得到最佳提取工艺参数为:超声波提取,乙醇浓度65.63%,料液比为1:10.55,提取时间为54.33 min,在此工艺参数下,槲皮苷的提取率为:2.44 mg·g-1,总黄酮的提取率为:106.88mg·g-1。

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序言

第一章 文献综述

1.1 热淋清颗粒

1.2 头花蓼药材

1.3 药物代谢动力学概述及应用

1.4 结论

第二章 热淋清颗粒中 GA 和 PCA 在大鼠体内血浆药代动力学研究

2.1 实验仪器与试药

2.2 大鼠血浆中 GA 和 PCA 分析方法的建立和验证

2.3 GA和PCA在大鼠血浆中的药代动力学研究

2.4 小结与讨论

第三章 口服热淋清颗粒 GA 和 PCA 在大鼠体内的组织分布研究

3.1仪器和材料

3.2 大鼠组织中GA和PCA分析方法的建立和验证

3.3 GA和PCA在大鼠各组织中的分布研究

3.4 结果与讨论

第四章 口服热淋清颗粒 GA 和 PCA 在大鼠体内的排泄研究

4.1仪器和材料

4.2 灌胃给予热淋清颗粒后 GA 和 PCA 在大鼠尿液中的排泄

4.3 灌胃给予热淋清颗粒后 GA 和 PCA 在大鼠粪便中的排泄

4.4 结果与讨论

第五章 头花蓼药材的提取工艺研究

5.1仪器及试剂

5.2 提取工艺研究

5.3 试验方法

5.4 结果与讨论

5.5 小结与讨论

第六章 结论与展望

6.1 实验结论

6.2 创新点

6.3 存在不足

6.4 展望

参考文献

附录

致谢