一株多糖高产菌株的研究与应用

摘要

随着糖化学、糖生物学、糖工程学发展，人们已认识到多糖物质具有重要的生物学功能，在工农业生产中有着广泛的应用前景；20世纪90年代以来，多种新方法、新技术被应用于多糖物质的研究中，一些不同生理活性的多糖物质被分离、纯化和鉴定，部分研究成果所形成的产品已投放市场，并显示出良好的经济效益。但大多数多糖产品主要来自高等植物和海藻及较大型的真菌，这在一定程度上限制了多糖的生产、应用及产业化进程。 近年来，由于细菌多糖具有结构功能稳定、价格便宜、生产周期短及生产可控等优点而倍受关注。本文对一株高产胞外多糖的细菌菌株进行了研究，主要内容为：菌株分离、筛选，发酵工艺优化、多糖提取工艺优化、多糖制品化学组成分析及其应用。 出发菌株为课题组自行分离所得的一株多糖产量较高的菌株，经生理生化特性分析及16SrDNA序列鉴定，鉴定该菌株为土壤杆菌属(Agrobacteriumsp.)的放射形土壤杆菌(A.radiobacter)，菌株编号为GY04。 本课题组历经二年左右时间，做了大量的工作，并取得了如下阶段性进展：1.采用无氮培养基、复筛培养基及基本发酵培养基从贵阳市郊土壤中筛选得到一株野生菌株，编号为GY04。经形念学观察、生理生化特性分析及16SrDNA序列分析，确定该菌株为土壤杆菌属的放射形土壤杆菌(A.radiobacter)。GY04为革兰氏阴性菌，细胞呈杆状，大小为1.2μm～1.8μm×0.5μm～0.8μm，单个或成对；荚膜染色显示，该菌株可产生荚膜；在基本发酵培养基上，28℃培养3～4d，菌落呈乳白色、有光泽、不透明、中凸、圆整、粘稠，菌落直径1cm左右。 GY04菌株好氧，生长温度范围为4℃～42℃，最适温度28℃，生长pH范围4～9，最适pH为7.0左右，不产色素，无芽孢，无动力，不能利用柠檬酸盐，可以产生3-酮基乳糖，并且可以利用乙醇氧化产酸，在石蕊牛奶培养基中产酸。 GY04菌株生长的延滞期为0～6h，6h后进入对数生长期，至96h生长量达到最大，96h至120h是GY04菌株生长的稳定期，120h后进入衰亡期。 2.GY04菌株的生长与产胶为非偶联型，对数生长期结束后开始分泌大量的胞外多糖。在摇瓶发酵条件下，GY04菌株产生多糖的最佳氮源为午肉膏，最佳碳源为乙二醇，发酵周期为5d。 将常规的优化法与统计学方法相结合，以胞外多糖的产量为指标，应用均匀设计法对发酵工艺进行优化，利用统计学软件SPSS10.0对结果进行分析，得到回归方程Y=0.223+1.835X1-0.106X2-0.0831X4-0.0642X5+0.02853X6，并根据方程得到最优的发酵工艺：牛肉膏0.20g/100mL，乙二醇0.25mL/100mL，碳酸钙0.20g/100mL，初始pH值7.0，接种量7％。与原有发酵条件相比，在最优条件下多糖产量提高了75.13％。 3.采用离心除菌、真空浓缩、95％乙醇沉淀、无水乙醇和乙醚洗涤、Sevage试剂脱蛋白等步骤处理发酵液可得到精制多糖。其工艺流程为： 离心—→80℃真空浓缩至原体积1/4—→3倍浓缩液体积的95％乙酵溶液沉淀—→过滤沉淀—→无水乙醇、乙醚洗涤沉淀—→粗多糖—→Sevage法除蛋白—→精制多糖 确定了多糖提取及初步纯化的方法，在降低提取纯化过程的成本的目标下，得到了较纯的精制多糖制品。 4.精制多糖样品为白色粉末。该样品不溶于水、NaOH溶液及醇、酮、醚等有机溶剂，微溶于二甲基亚砜溶液，溶于1M的盐酸溶液，该多糖样品的酸溶液为微黄色澄清溶液，可能是由于部分多糖被酸化造成水解而使溶液变得微黄。多糖样品在水溶液中形成悬浊液，1％的多糖悬浊液在加热时可形成微凝胶。 GY04菌株所产胞外多糖是一种新型的以葡萄糖、鼠李糖两种单糖组成的杂多糖，其红外谱显示此多糖是一种吡喃多糖，含有乙酰基。运用电子探针二次电子成像分析技术得到了该多糖样品的几种“晶形”，并且通过元素分析证明该菌株可以分解钾长石，并释放出部分营养元素。 5.在对多糖结构与性质初步了解的基础上，对其应用作了如下探讨，具体表现在对生活污水的处理及在土壤水土保持方面：由GY04菌株所制成的含有大量多糖产物的菌剂在对生活污水的处理中，取得了较好效果；在增强土壤持水能力方面也有显著效果。究其原因，作者认为，与其胞外多糖的性质是分不开的，一方面胞外多糖本身为大分子物质，它可以有效吸附悬浮物；另一方面，多糖分子中含有极性基团和未饱和残基，这使微生物絮凝剂分子借助离子键、氢键、范德华力的作用吸附多种带电颗粒，而降低粒子间的斥力势能使溶胶聚沉并可以吸附水分而使得土壤持水能力提高。 通过本论文对GY04菌株及其胞外多糖的研究，明确了GY04所产胞外多糖是一种新型多糖。作者认为GY04菌株及其胞外多糖有较高的研究价值和工业化潜力。

目录

文摘

英文文摘

第一章绪论

第二章GY04菌株的分离、筛选与鉴定

第三章细菌产胞外多糖发酵条件的优化

第四章细菌胞外多糖的提取、纯化与结构分析

第五章细菌GY04菌株的初步应用

第六章结论与展望

攻读硕士学位期间发表论文

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