奶牛隐性乳房炎金黄色葡萄球菌分离鉴定及其肠毒素分析

摘要

[目的]：
　　了解贵阳地区奶牛隐性乳房炎的感染情况及其主要菌群，探讨牛乳中主要病原菌金黄色葡萄球菌的PCR快速检测方法，然后对其进行肠毒素的分析，为保障牛乳的食用安全提供检测技术支持。
　　[方法]：
　　采用C.M.T检测方法对贵阳地区奶牛场无乳房炎临床症状泌乳期奶牛进行隐性乳房炎的调查，然后选取隐性乳房炎乳样进行细菌分离与鉴定，并对主要病原菌进行体外药敏试验。
　　针对隐性乳房炎中的优势菌即金黄色葡萄球菌23SrRNA设计引物，建立牛乳中金黄色葡萄球菌的PCR检测方法并对金黄色葡萄球菌分离菌株进行检测和PCR反应条件的优化，然后在临床鲜乳中进行检测试验。
　　对金黄色葡萄球菌分离株进行A型肠毒素菌株的筛选，然后进行A型肠毒素全基因的扩增并进行序列分析。
　　[结果]：
　　贵阳地区1700头份泌乳期奶牛乳样，经C.M.T法检测阳性680份，检出率为40％(680/1700)；随机选取90份隐性乳房炎乳样进行细菌的分离鉴定，共分离出细菌188株，主要是葡萄球菌属和链球菌属细菌，其中金黄色葡萄球菌62株，占32.90％(62/188)；药敏试验显示，丙氟哌酸、氟哌酸、利福平和先锋霉素V等对隐性乳房炎主要致病菌具有良好的抑菌效果，而青霉素类和链霉素类抗生素的抑菌效果较差。
　　采用金黄色葡萄球菌23SrRNA引物进行PCR扩增，结果金黄色葡萄球菌标准株呈现与预期大小(1250bp)相一致的DNA条带，且最小的DNA模板检出量为0.1ng，而对表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、大肠埃希氏菌、都柏林沙门氏菌、无乳链球菌、绿脓假单胞菌和变形杆菌等均为阴性反应。对62株金黄色葡萄球菌分离株进行PCR检测，能扩增出特异性DNA条带的有56株，与传统生化鉴定方法的符合率达90.32％(56/62)。选取2株金黄色葡萄球菌分离株PCR产物进行测序，该片段大小为1250bp，与GenBank收录的金黄色葡萄球菌参考株相应序列的同源性高达99.0％～100％。应用该PCR方法对鲜乳中金黄色葡萄球菌进行检测显示，其最小检测菌液浓度为103cfu/mL，且与传统生化鉴定结果的符合率达90.91％(20/22)。
　　采用金黄色葡萄球菌A型肠毒素基因片段引物，对56株金黄色葡萄球菌分离株进行PCR扩增，结果有6株金黄色葡萄球菌分离株能扩增出与预期大小(102bp)相一致的DNA条带，即金黄色葡萄球菌A型肠毒素菌株的检出率为10.71％(6/56)。以金黄色葡萄球菌A型肠毒素全基因引物对6株金黄色葡萄球菌A型肠毒素菌株进行PCR扩增，可得到大小为702bp的特异性DNA条带；应用生物信息学软件分析，金黄色葡萄球菌分离菌株的A型肠毒素基因与GenBank收录菌株的相应序列的核苷酸同源性高达100％，推导的氨基酸肽链40～43、78～81、114～117、132～136、146～149和214～220区域及其附近存在潜在的优势抗原表位。
　　[结论]：
　　(1)贵阳地区奶牛场奶牛隐性乳房炎感染率达40％(680/1700)，主要致病菌为葡萄球菌属和链球菌属细菌。
　　(2)丙氟哌酸、氟哌酸、利福平和先锋霉素V等抗生素对贵阳地区奶牛场奶牛隐性乳房炎具有良好的治疗与预防效果。
　　(3)建立了一种高特异性、敏感性的鲜乳中金黄色葡萄球菌PCR检测方法。
　　(4)分析了金黄色葡萄球菌A型肠毒素基因，为乳中金黄色葡萄球菌A型肠毒素检测方法的进一步研究奠定了基础。

目录

封面

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中文摘要

英文摘要

文献综述

实验研究

1 材料

1.1 乳样

1.2 菌株

1.3 培养基

1.4 生化管

1.5 主要试剂及药品

1.6 试验仪器

1.7 引物

2 方法

2.1 奶牛隐性乳房炎病原菌的分离鉴定与药敏试验

2.2 金黄色葡萄球菌 PCR 鉴定方法的建立与应用

2.3 金黄色葡萄球菌肠毒素鉴定与分析

3 结果

3.1 奶牛隐性乳房炎病原菌的分离鉴定与药敏试验结果

3.2 金黄色葡萄球菌 PCR 鉴定方法的建立与应用结果

3.3 金黄色葡萄球菌肠毒素鉴定与分析结果

4 讨论

4.1 关于奶牛乳房炎

4.3 关于奶牛隐性乳房炎抗生素疗法

4.5 关于鲜牛奶中金黄色葡萄球菌含菌量调查

4.6 关于从牛奶中快速检测金黄色葡萄球菌的 PCR 方法

4.7 关于金黄色葡萄球菌肠毒素

4.8 关于金黄色葡萄球菌 A 型肠毒素

4.9 关于金黄色葡萄球菌 A 蛋白的抗原表位预测

5 结语

致谢

参考文献

附录一 发表论文情况

附录二 培养基和染色液的配制及染色方法

附录三 药敏纸片法的抑菌范围解释标准

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