大青叶蝉内共生菌及营养功能研究

摘要

大青叶蝉 Cicadella viridis隶属于半翅目Hemiptera、叶蝉科Cicadellidae、大叶蝉亚科Cicadellinae。该虫分布范围较广，可危害160多种植物，同时在危害过程中还传带一些病毒病，是果树、林木尤其是苗木和幼树的大敌。本文对大青叶蝉内共生菌的种类进行了鉴定，用TaqMan探针法绝对定量PCR检测了大青叶蝉不同龄期和解剖器官中内共生菌16SrRNA基因的拷贝数，研究了不同抗生素对大青叶蝉内共生菌的去除效果，探讨了抗生素处理对大青叶蝉氨基酸、总蛋白含量以及主要保护酶、解毒酶和转氨酶的影响。以期为不同地理种群大青叶蝉内共生菌的差异、内共生菌基因的功能研究以及大青叶蝉感染内共生菌与其线粒体基因之间的多样性研究提供一定的理论依据。
　　本研究主要内容包括：⑴Sulcia muelleri隶属于拟杆菌门 Bacteroidetes、黄杆菌纲 Flavobacteria、黄杆菌目 Flavobacteriales、黄杆菌科 Flavobacteriaceae，该内共生菌有13个新单倍型，14个变异位点，其序列间的一致率和遗传距离分别为99.40%-99.80%和0.001-0.004；系统发育树显示，Sulcia muelleri与大叶蝉亚科中检测到的Sulcia muelleri聚在一起，其变异程度低，所有单倍型为同一个种。⑵Sodalis sp.属于变形杆菌门 Proteobacteria、伽马变形菌纲Gammaproteobacteria、肠杆菌目 Enterobacteriales、肠杆菌科 Enterobacteriaceae，本研究获得5个新单倍型，20个变异位点，其序列间的一致率为96.10%-99.70%，遗传距离范围为0.012-0.040；系统发育树显示， Sodalis sp.与采采蝇GIossina morsitans morsitans检测到的Sodalis glossinidius聚在一起，其变异相对较大，属于同一个属。⑶Rickettsia sp.属于变形杆菌门Proteobacteria、阿尔法变形菌纲Alphaproteobacteria、立克次氏体目Rickettsiales、立克次氏体科Rickettsiaceae，该内共生菌有15个单倍型，35个变异位点，其序列间的一致率为98.40%-99.90%，遗传距离最小为0.001，最大为0.015；系统发育树显示，所有单倍型属于Rickettsia属的bellii group。⑷大青叶蝉各个发育时期（卵、若虫、雌雄成虫）均感染率了内共生菌Sulcia mueller、Sodalis sp.和Rickettsia sp.，且感染率为100%；从卵到5龄，三种内共生菌的拷贝数除了在3龄时减少外，其余龄期均增加。内共生菌Sulcia muelleri在5龄若虫中拷贝数最高，其次是雌虫，卵中最低；内共生菌Sodalis sp.在雌虫中最多，其次是5龄若虫，卵中最少；内共生菌Rickettsia sp.在5龄中分布最多，其次是雌虫，卵和3龄若虫的拷贝数相当。⑸在不同解剖器官或组织中，Sulcia muelleri、Sodalis sp内共生菌在菌胞体中的拷贝数最高，在雄虫的中肠、雌雄唾液腺中很少；Rickettsia sp.在卵巢中的数量最多。表明大青叶蝉不同龄期、器官均感染了3种内共生菌，且3种内共生菌的含量不同。⑹用大青叶蝉内共生菌Sulcia muelleri、Sodalis sp.和Rickettsia sp.的特异性引物，检测其在大青叶蝉成虫中的感染率；同时用利福平、盐酸土霉素、青霉素G钾盐三种抗生素处理大青叶蝉1日龄若虫，用TaqMan探针法绝对定量PCR检测不同处理时间大青叶蝉内共生菌拷贝数。结果表明：大青叶蝉内共生菌Sulcia muelleri、Sodalis sp.和Rickettsia sp.的带菌率均为100%。对于内共生菌Sulcia muelleri，其盐酸土霉素的去除效果相对较好；对于内共生菌Sodalis sp，处理时间不同，抗生素的去除效果有一定差异，处理5 d和10 d时，利福平的去除效果较好，处理15 d、20 d、33-35 d（雄成虫）和35-37 d（雌成虫）时，盐酸土霉素的去除效果较好；对于Rickettsia sp.，在处理前期，利福平去除内共生菌Rickettsia sp.的效果较好，但到成虫期，盐酸土霉素的去除效果较好。利福平、盐酸土霉素、青霉素G钾盐3种抗生素均可使内共生菌的量减少，但不能完全消除。⑺经抗生素处理后，处理组中的必须氨基酸含量增加，非必须氨基酸含量减少，总氨基酸含量减少。七种必须氨基酸，处理组雄虫中的含量高于对照组雄虫；处理组雌虫中，除了赖氨酸的含量减少外，其余6种必须氨基酸的含量均增加。非必须氨基酸中，处理组试虫中除了胱氨酸、脯氨酸和酪氨酸的含量减少以外，其余氨基酸的含量均增加。⑻在处理的第5d，处理试虫体内的总蛋白含量比对照少，但减少不显著；然后又有所升高，雌虫中的总蛋白含量变化显著，而雄虫的总蛋白含量变化不显著。经抗生素处理后，大青叶蝉体内的氨基酸和总蛋白含量量发生了变化。⑼抗生素处理第5d时，三种保护酶的活性呈显著或极显著升高；处理第15 d时，过氧化物酶的活性下降不显著，总超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性呈极显著或显著降低；在成虫期，三种保护酶的活性呈显著或极显著下降。⑽抗生素处理第5d，三种解毒酶的活性均极显著升高；处理第15d时，谷胱甘肽S-转移酶变化不显著，羧酸酯酶的活性显著降低，乙酰胆碱酯酶的活性呈极显著下降；在成虫期，三种解毒酶的活性呈显著性或极显著性下降。⑾抗生素处理第5d，三种转氨酶的活性显著升高；第15d时活性显著下降；雌虫中谷丙转氨酶的活性变化不显著，但谷氨酰胺合成酶和谷草转氨酶的活性均显著降低；雄虫中的三种转氨酶的活性呈显著或极显著下降。经抗生素处理后，其大青叶蝉体内的保护酶、解毒酶和转氨酶活性均发生了变化。

目录

第一章 文献综述

1 大青叶蝉及其危害

2昆虫内共生菌研究概况

3 叶蝉内共生菌的研究进展

4 昆虫体内的相关酶系

5实时荧光定量PCR的应用

6 研究目的及意义

7技术路线

第二章 大青叶蝉内共生菌的检测

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

第三章 内共生菌在大青叶蝉中的分布

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

第四章 三种抗生素对大青叶蝉内共生菌去除效果的比较

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

第五章 抗生素处理对大青叶蝉氨基酸和总蛋白含量的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

第六章 抗生素处理对大青叶蝉保护酶、解毒酶及转氨酶活性的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论与讨论

第七章 全文总结

1 主要结论

2本文的创新之处

3本研究的不足之处及今后的研究方向

致谢

参考文献

附录

图版Ⅰ大青叶蝉不同龄期图

图版Ⅱ 大青叶蝉内部器官或组织图

图版Ⅲ 谷丙转氨酶和谷草转氨酶标准曲线图

图版Ⅳ 大青叶蝉氨基酸检测图谱

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