猪伪狂犬病毒贵州株的分离鉴定及gB/gE/TK基因分子特征分析

摘要

猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一种猪的急性传染病，临床上母猪主要出现繁殖障碍，产死胎或木乃伊胎；种公猪出现精液带毒；仔猪出现神经症状，直至死亡。近 30 年来我国广泛应用伪狂犬病基因缺失疫苗，使该病得到了有效的控制。但在 2011 年底我国再次出现猪伪狂犬病的爆发流行，有的地方发生了流行毒株的变异，使我国的养猪业遭受了巨大的经济损失。猪伪狂犬病的净化已被列为《国家中长期动物疫病防治规划》（2012-2020年）。本研究通过采集疑似猪伪狂犬病的哺乳仔猪病料，经 PCR 检测确定为PRV感染后分离伪狂犬病病毒，通过细胞培养、电镜观察形态结构、TCID50测定、易感动物接种实验成功分离PRV贵州株，经并分别对分离毒株的 gB/gE/TK 基因进行克隆与基因分子特征分析，以期为贵州省猪伪狂犬病的净化提供理论依据。 1.伪狂犬病病毒T4贵州株的分离鉴定 通过采集疑似猪伪狂犬病的哺乳仔猪，对病料进行相关处理后进行病毒的分离鉴定，通过细胞培养、电镜观察形态结构、TCID50测定、易感动物接种实验和以及病毒核酸序列的同源性分析鉴定，结果表明：病料接种 Vero 细胞，盲传到第 4 代的时候，在接毒后 60 h 产生明显的细胞病变效应（CPE），传到第 6 代的时候出现稳定的 CPE；电镜观察发现分离毒株具有疱疹病毒共同形态特征，经透射电镜观察可见病毒粒子呈椭圆形或圆形，细胞核内呈晶格状排列的无囊膜的包涵体，直径约为120～150 nm，胞浆内和胞核内有囊膜的成熟的病毒粒子的直径为150～180 nm；将第 6 代病毒液接种到家兔后，实验组的 2 只家兔在接种病毒后 52 h 出现明显的瘙痒症状，最终死亡；PC R产物测序结果对比为 PRV。本实验成功分离一株伪狂犬病病毒，命名为 PRV-T4 分离株，测得其 TCID50为 10-6.24/100μL，与本实验室郝飞等 2013 年分离的 Guizhou-DY株 TCID50（10-9.71/100μL）（郝飞等，2013）、曾智勇等 2011 年分离的 GZ-Z1 株 TCID50为（10-7.26/100μL）（曾智勇等，2011）相比，本次分离的 PRV-T4 分离株 TCID50更低。该分离结果表明，该猪场存在PRV野毒感染。 2.PRV-T4分离株gB/gE/TK基因克隆及测序 实验以 PRV-T4 分离株为研究对象，设计 3 对特异性引物，分别用 LA-Taq 酶扩增 gB、gE 和 TK 基因的全基因，反应条件为：94℃ 预变性 5 min，94℃ 变性 1 min，62℃（gB 基因）/55℃（gE/TK 基因）退火 1 min，72℃ 延伸 45 s，共 35 个循环，最后72℃延伸10 min，4℃，保温。反应结束后取 5μL PCR产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，将剩下的 45μL 产物进行胶回收纯化后克隆到 pMD19-T 载体上，并转化至 DH5α 感受态细胞中。通过菌落PCR鉴定阳性菌落后在含 Amp 的 LB 液体培养基中增菌培养，抽提质粒，对重组质粒进行BamHⅠ/EcoRⅠ 双酶切鉴定，电泳检测得到与预期相符的一大一小的两个条带，将阳性质粒送北京六合华大基因测序，测序结果为：gB 基因2 751 bp，gE 基因1 737 bp，TK 基因 938 bp，与预期结果相符，表明克隆成功，将构建成功的重组质粒命名为：pMD19-T4-gB、pMD19-T4-gE 和pMD19-T4-TK。该研究为进一步开展 PRV-T4 分离株 gB/gE/TK 基因相关研究奠定了基础。 3.PRV-T4分离株gB/gE/TK基因生物信息学分析 分别将克隆并测序成功的 PRV-T4 分离株的 gB/gE/TK 基因序列，利用生物软件对其核苷酸序列和蛋白质序列进行分析。结果表明：本实验所分离得到的 PRV-T4 分离株与国内经典毒株Bartha 株、La 株、Fa 株相比，gB 基因编码的氨基酸序列分析显示，本实验分离的 PRV-T4 分离株在 gB 基因编码的氨基酸第 395 位、第 562 位、第 739位均无氨基酸的变化；与国内经典毒株 Ea 株、Yangsan 株、GDSH 株 gE 基因编码的氨基酸序列分析显示，gE 基因编码的氨基酸序列第 48 位、第 496 位、第 498 位均有 1 个天冬氨酸 (Asp D)的插入；与国内经典毒株 Bartha 株、La 株、Fa 株、MinA 株，本实验分离的 PRV-T4 分离株在 TK 基因编码的氨基酸第 16 位、第 129 位、第 215位和第 284 位均没有发生相关的突变。PRV-T4 分离株的 gB/gE/TK 基因 G+C 含量分别为 71.03％、74.09％ 和 74.40％，均含有丰富的二级结构，且亲水性氨基酸均匀分布于整条肽链，且与疏水性氨基酸数量差异不明显，具有较强的亲水性。 结果表明：本实验所分离得到的 PRV 为变异株。推测可能由于近年来贵州省养猪业的快速发展，跨区引种导致猪群流动性增加导致。该研究对我省预防、控制及净化PR 具有一定的指导意义。

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摘 要

第一章 文献综述

1 伪狂犬病毒概述

1.1 伪狂犬病毒简介

1.2 伪狂犬病的流行病学

1.3 伪狂犬病毒的分子生物学特性

1.3.1 基因组结构

1.3.2 基因的功能

1.4 致病机理

2 猪伪狂犬病的诊断

2.1 临床诊断

2.2 传统诊断方法

2.2.1 病原学诊断

2.2.2 病毒粒子的形态观察

2.2.3 动物接种实验

2.3 血清学诊断方法

2.3.1 血清中和实验（SNT）

2.3.2 乳胶凝集实验（LAT）

2.3.3 免疫荧光技术（IF）

2.3.4 酶联免疫吸附实验（ELISA）

2.3.5 反向间接血凝（抑制）实验(RPHA/RPHI)

2.4 分子生物学诊断

2.4.1 聚合酶联反应技术（PCR）

2.4.2 核酸探针检测技术

3 伪狂犬病疫苗研究进展

3.1 PR传统疫苗

3.1.1 灭活疫苗

3.1.2 弱毒疫苗

3.2 基因工程疫苗

3.2.1 基因工程亚单位疫苗

3.2.2 核酸疫苗

3.2.3 基因缺失弱毒疫苗

4 PRV国内流行毒株gB/gE/TK基因分子特征的研究进展

5 研究目的及意义

第二章 伪狂犬病病毒T4贵州株的分离鉴定

1 材料

1.1 病料、细胞

1.2 主要试剂

1.3 实验动物

1.4 主要溶液的配制

1.4.1 50×TAE

1.4.2 1%琼脂糖凝胶电泳液

1.4.3 无钙镁水（CMF）

1.4.4 含10％ FBS细胞营养液

1.4.5 含2％ FBS细胞维持液

1.4.6 含20％ FBS细胞冻存液液

1.5 主要实验仪器

2 方法

2.1 病料的处理

2.2 疑似病例的PCR检测

2.2.1引物的设计与合成

2.2.2 病毒核酸PCR扩增

2.3 病毒的分离培养

2.3.1 细胞的复苏

2.3.2 病毒的分离培养

2.4 病毒的效价的测定

2.5 家兔感染实验

2.6 病毒的形态观察

2.7 病毒核酸序列的鉴定

2.7.1 引物设计与合成

2.7.2 病毒核酸PCR扩增

3 结果与分析

3.1 疑似病例的PCR检测结果

3.2 病毒的分离培养结果

3.3 病毒效价的测定结果

3.4 家兔感染实验结果

3.5 病毒的形态观察

3.6 病毒核酸序列的鉴定结果

4 讨论

5 结论

第三章 猪伪狂犬病毒贵州株gB/gE/TK基因的克隆及测序

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 载体及宿主菌

1.3 主要溶液的配制

1.3.1 EDTA（250 mM）

1.3.2 0.15M PBS(PH7.4）

1.3.3 LB液体培养基

1.3.4 LB琼脂培养基

1.3.5 50×TAE

1.3.6 1％琼脂糖凝胶电泳液

1.3.7 Amp贮存液（200mg/mL）

1.3.8 细菌保存液

1.4 主要实验仪器

2 方法

2.1 引物设计与合成

2.2 DNA的提取

2.3 病毒核酸的PCR扩增

2.4 目的基因的回收纯化

2.5 目的基因与pMD19-T载体的连接

2.6 重组质粒的转化

2.7 菌落PCR

2.8 重组质粒的抽提

2.9 重组质粒的酶切鉴定

2.10 重组质粒的DNA序列测定

3 结果

3.1 PCR产物电泳检测结果

3.2 菌落PCR结果

3.3 重组克隆质粒酶切鉴定结果

3.4 序列测定结果

4 讨论

5 结论

第四章 PRV-T4分离株gB/gE/TK基因生物信息学分析

1 材料

1.1 生物信息在线分析网站

1.2 生物信息分析软件

2 实验方法

2.1 PRV-T4 分离株 gB/gE/TK 基因核苷酸序列同源性分析

2.2 PRV-T4 分离株 gB/gE/TK 基因核苷酸遗传进化树分析

2.3 PRV-T4 分离株 gB/gE/TK 基因氨基酸序列同源性分析

2.4 PRV-T4 分离株 gB/gE/TK 基因基因编码蛋白质基本特征分析

2.5 PRV-T4 分离株 gB/gE/TK 基因蛋白质二级结构预测

2.6 PRV-T4 分离株 gB/gE/TK 基因蛋白质三级级结构预测

3 结果分析

3.1 PRV-T4 分离株 gB/gE/TK 基因核苷酸序列同源性分析

3.1.1 gB/gE/TK 基因序列整理

3.1.2 PRV-T4分离株gB/gE/TK 基因核苷酸及其编码氨基酸变异情况

3.1.3 PRV-T4 分离株 gB/gE/TK基因核苷酸序列同源性分析

3.2 PRV-T4 分离株 gB/gE/TK基因核苷酸序列遗传进化树分析

3.3 PRV-T4 分离株 gB/gE/TK基因编码蛋白质基本特征分析

3.4 PRV-T4 分离株 gB/gE/TK基因编码蛋白质二级结构分析

3.5 PRV-T4 分离株 gB/gE/TK基因编码蛋白质三级结构预测

4 讨论

5 结论

主要参考文献

致 谢

附 录一 攻读硕士学位期间参与发表的论文

附 录二 本文用到的部分英文缩写及含义说明