不同品种羊Mo感染差异性研究

摘要

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，Mo)是引起山羊、绵羊出现以高热、咳嗽、渐进性消瘦和间质性肺炎症为主要临床特征的高度接触性传染病病原，自1963年首次从绵羊病例分离获得Mo，许多国家如英国、西班牙、新西兰、澳大利亚、非洲、匈牙利、冰岛、土耳其等相继报道Mo感染病例。我国1985年首次报道Mo分离，此后甘肃、宁夏、四川、云南、江苏、辽宁、内蒙、山东、新疆、广西、湖北等地报告Mo致病山羊、绵羊病例。贵州省于2011年从山羊病例中首次分离到Mo，且呈现出不同品种羊易感性差异，给地方养羊业发展带来巨大威胁。为探讨Mo感染不同品种羊差异性，本研究选择贵州主要养殖品种贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊、波尔山羊、湖羊为实验动物，以Mo贵州分离株为感染病原，分析Mo人工感染不同品种山羊病原学、病理学差异，探讨Mo感染不同品种羊差异性表现的特征与机理，为Mo致羊支原体肺炎的致病机理和防控提供研究资料。 1.不同品种羊Mo感染试验 Mo是引起贵州省山羊、绵羊传染性胸膜肺炎的主要病原体，且呈现不同品种羊感染差异。为比较Mo贵州分离株对不同品种羊感染差异性，本文选择白山羊、黑山羊、麻羊等地方品种羊和波尔山羊、湖羊等引进品种羊为试验对象进行Mo人工感染试验，通过统计实验羊临床表现及病原分离鉴定分析Mo人工感染临床表现差异及感染可能性。结果可见，以4×108CCU/只的Mo经气管途径感染5个品种羊呈现不同的死亡率，黑山羊和白山羊最高（100%），其次是麻羊（66.67%）和波尔山羊（33.33%），湖羊均未死亡，对照组未出现死亡。Mo感染不同品种羊呈现白山羊最早出现死亡（感染后48h），于感染后120h全部死亡，黑山羊于感染后72h~144h全部死亡，麻羊于感染后72~96h死亡2只，波尔山羊于感染后144h死亡一只，而湖羊至感染后30d均未死亡。白山羊、黑山羊和麻羊感染Mo后出现咳嗽、流脓鼻涕和呼吸困难的症状；而波尔山羊和湖羊整体表现精神沉郁、偶尔咳嗽的症状，对照组未出现症状。采集各品种羊感染组和对照组组织进行Mo分离与鉴定显示，各品种羊感染组样本均能分离获得Mo，形态学、生物化学、分子生物学鉴定证实与Mo贵州分离株相同，而各品种羊对照组均未检测到Mo的存在。实验结果表明，Mo感染不同品种羊存在明显病程、死亡率、临床表现差异，提示可能存在病原组织嗜性、病理组织学和炎症细胞与分子的差异。 2.Mo感染不同品种羊组织病变与Mo核酸载量差异性研究 绵羊肺炎支原体（Mo）感染不同品种羊存在明显的临床表现差异，提示可能存在感染羊组织病变差异、组织Mo核酸载量差异，而这可能与不同品种羊Mo易感性存在相关关系，但目前缺乏相关研究资料。本文应用Mo贵州分离株分别感染5种实验羊，并于感染羊自然死亡和人工处死后采集组织样本开展肺脏病理变化和组织Mo核酸载量研究。结果可见，不同品种羊均存在气管有黏液、气管出血病变，胸腔积液，肺脏粘连、坏死等症状；黑山羊感染组肺脏粘连病变较其他品种严重；白山羊和黑山羊感染组胸腔积液病变较其他品种严重；白山羊感染组气管黏液病变较其他品种严重。对各品种实验羊肺脏进行病理组织切片，在显微镜下观察到肺泡隔毛细血管高度扩张充血，肺泡腔中见大量浆液、少量白细胞，以及大量的炎症细胞、纤维素、红细胞和肺泡上皮细胞；细支气管周围组织被炎症细胞浸润，且细支气管腔充满浆液或炎症细胞浸润；对不同品种实验羊进行组织病理评分，结果白山羊＞黑山羊＞麻羊＞波尔山羊＞湖羊，表明白山羊的肺炎最为严重，湖羊的肺炎最轻。应用实时荧光定量PCR技术对各品种实验羊肺脏、气管、心脏、肝脏、脾脏、肾脏等进行Mo核酸载量定量分析显示，Mo在不同品种羊气管中的相对含量均最高，都极显著高于其他组织（P＜0.01），其次是肺脏，而在脾脏、肝脏和肾脏中的含量较低，这提示Mo主要侵害感染羊呼吸系统；黑山羊心脏中Mo的相对含量为4.66，极显著高于其他品种羊（P＜0.01），心脏中Mo的相对含量最少的品种是白山羊，表明Mo感染后损伤心血管系统最严重的品种是黑山羊。5个品种羊肝脏中Mo相对含量最多的品种是麻羊，极显著高于其他品种羊（P＜0.01），而最少的品种则是白山羊，推测Mo对麻羊较其他品种羊更易遭受肝脏侵染。5个品种羊脾脏和肾脏中Mo相对含量最多的品种都是湖羊，含量分别为2.38和1.44，都极显著高于其他品种羊（P＜0.01），而最少的品种则是麻羊，推测湖羊通过脾脏和肾脏等途径代谢Mo逐步降低其危害。上述研究结果表明，Mo感染不同品种羊存在组织病变和组织Mo核酸载量差异。 3.Mo感染不同品种羊炎症相关细胞、分子差异性分析 Mo感染不同品种羊存在明显组织病变和Mo核酸载量差异，提示感染羊可能存在炎症细胞与炎症分子的差异，因此，本文对采集于不同感染时间的血液样本进行炎症细胞和炎症分子差异性分析。应用血液分析仪对各品种实验羊血液样本检测显示，5个品种羊感染组血液中的白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的含量整体呈现上升趋势；黑山羊和白山羊在感染Mo后血液中炎症细胞呈持续性上升，直至死亡，且血液中白细胞和中性粒细胞的数量高于其他品种，表明白山羊和黑山羊的炎症最为严重；麻羊、波尔山羊和湖羊感染Mo后血液中的各类炎症细胞均为先增加后降低，表明感染Mo后初期存在较严重炎症反应，之后变为慢性炎症。应用ELISA技术对各品种Mo感染组血清进行CD3、CD4、CD8的检测，结果显示，白山羊血清中CD3含量高于其他品种，表明其在Mo感染后免疫反应比其他品种强；波尔山羊和麻羊血清中CD4高于其他品种，表明其在Mo感染后免疫应答反应比其他品种强；在96h麻羊血清中CD8含量显著高于其他品种（P＜0.05），表明其在Mo感染后识别和呈递抗原作用比其他品种强。应用ELISA技术对各品种实验羊血清进行IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-α、IFN-β的检测，结果显示，不同品种实验羊血清中的炎症分子含量整体呈现上升出趋势，其中IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-α、IFN-β含量整体呈现上升趋势；白山羊感染组血清中IL-2在96h时显著高于其他品种（P＜0.05），表明白山羊的炎症在96h时炎症水平高于其他品种；白山羊和黑山羊感染组血清中IL-6含量一直在升高，且黑山羊在144h时显著高于其他品种（P＜0.05），表明白山羊和黑山羊炎症的严重程度高于其他品种，在144h时黑山羊炎症最为严重；白山羊和黑山羊感染组血清中IL-8含量呈现一直升高，表明白山羊和黑山羊感染后纤维素病变在不断的加重；麻羊感染组血清中IL-10含量在感染144h后一直极显著高于其他品种（P＜0.01），表明麻羊在144h后对Mo的抵抗强于其他品种，临床表现为耐过初期感染后病情稳定。湖羊感染组血清中TNF-α含量一直高于其他品种，表明湖羊对Mo感染在促进细胞生长分化、调节免疫应答水平比其他品种强，从而能够更快的抵御Mo侵染。 结论：Mo贵州分离株人工感染贵州黑山羊、贵州白山羊、黔北麻羊、波尔山羊、湖羊呈现不同的临床表现、组织病变，各品种感染羊Mo组织含量存在差异，与临床表现成正相关，炎症细胞和炎症分子变化水平与死亡情况呈正相关。研究资料为探讨不同品种羊Mo易感性机理和防控提供研究资料。

目录

英文缩略词

文献综述:绵羊肺炎支原体研究进展

第一章 不同品种羊Mo感染试验

1 材料

1.1 菌株及实验动物

1.2 试剂

1.3 主要仪器

2.1 Mo菌种准备

2.2 人工感染试验

2.3 感染羊病原学鉴定

3.1 Mo培养结果

3.2 实验羊临床表现

3.3 实验羊病原学鉴定结果

4 讨论

4.1 关于实验羊选择与接种方式

4.2 关于感染羊鉴定

4.3 关于Mo的鉴定

第二章 不同品种羊Mo感染组织病变与Mo核酸载量差异性研究

1 材料

1.1组织样本

1.2 试剂

1.3 主要仪器

2.1 实验羊组织病变观察

2.2不同品种羊Mo核酸载量差异性分析

3 结果

3.1 不同品种实验羊大体病变差异性分析

3.2 不同品种实验羊显微病变差异性分析

3.3 不同品种实验羊组织Mo核酸载量差异性分析结果

4 讨论

4.1 关于病原致病种间差异性

4.2 关于组织病理变化的统计分析

4.3 关于组织中Mo核酸载量定量分析

第三章 Mo感染不同品种羊炎症相关细胞、分子差异性分析

1 材料

1.1血液样本

1.2试剂

1.3 仪器

2 方法

2.1 血液样本的采集

2.2 不同品种羊炎症细胞检测与差异性分析

2.3 不同品种羊炎症分子检测与差异性分析

3.1 血液样本统计

3.2 Mo感染不同品种实验羊炎症细胞差异性分析

3.3 感染不同品种实验羊炎症相关分子差异性分析

4 讨论

4.1 关于炎症细胞与炎症反应关系

4.2 关于炎症分子与炎症反应关系

4.3 关于炎症反应水平与病原致病性关系

全文结论

致谢

参考文献

附录一 参与文章发表情况

附录二 生化实验步骤和Mo核酸载量数据

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