Mo感染诱导不同品种羊TLRs及其通路因子表达差异性研究

摘要

绵羊肺炎支原体（Mo）是羊支原体肺炎的主要病原，以3月龄山羊和绵羊最为易感，患羊肺部发生纤维素性渗出炎症为主要特征。不同品种羊对羊支原体肺炎易感性存在差异，分析认为与不同品种羊免疫反应存在相关关系。Toll样受体（TLRs）是机体重要的免疫相关分子，主要分布于上皮细胞、免疫细胞等，通过识别病原相关分子模式，将信号沿着MyD88途径或TRIF途径进行传递，调控NF-κB、AP-1等分子转录，最终启动免疫细胞增殖和炎性细胞因子表达，帮助机体抵御和清除病原体。然而不可控的炎症反应，将会造成机体组织损伤。本研究在分析不同种羊（黑山羊、白山羊、麻羊、波尔山羊和湖羊）Toll样受体基因及表达多态性基础上，通过Mo人工感染5种羊，以典型病变组织样本肺脏和全身性炎症样本血液为研究对象，采用TaqMan实时荧光定量PCR方法，从TLR1-10基因含量水平、TLR1-10基因转录水平、MyD88和TRIF信号通路重要接头分子转录水平探讨不同品种羊感染Mo后，Toll样受体及其通路因子表达差异性，为研究Toll样受体与支原体肺炎易感性关系奠定基础性研究资料。 1.Mo感染不同品种羊TLRs基因水平差异性研究 5种实验羊进行Mo人工感染显示不同品种羊Mo感染后病程、死亡率和炎症水平存在差异，其中死亡率从高到低依次为白山羊、黑山羊、麻羊、波尔山羊和湖羊，其中湖羊和各对照组均无死亡。采集实验组血液样本122份、肺脏样本25份进行TLR1-10基因定量检测与分析。实验羊肺脏样本TLRs基因定量检测分析显示，同种羊感染组肺组织中TLR2/4/5/6/8/9基因含量显著高于对照组（P＜0.05），而TLR3/7/10感染组与对照组差异不显著（P＞0.05）；各品种羊感染组肺组织中TLR1基因含量与对照组相比存在种间差异。种内比较结果提示TLRs参与Mo感染过程，且存在种间差异。不同种羊感染组肺组织中TLR1-10基因含量差异性分析显示，白山羊肺组织中TLR2基因含量极显著高于黑山羊、麻羊、波尔山羊和湖羊（P＜0.01），黑山羊TLR10基因含量极显著高于白山羊、麻羊、波尔山羊和湖羊（P＜0.01），黑山羊、白山羊TLR6和TLR8基因含量极显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊（P＜0.01），麻羊、波尔山羊TLR4/5基因和湖羊TLR5基因含量极显著高于白山羊和黑山羊（P＜0.01）。种间比较结果提示TLR2/4/6/8可能参与黑山羊、白山羊、麻羊感染早期炎症的快速发展并导致死亡。 不同种羊血液样本TLRs基因定量检测分析显示，同种羊不同时段血液样本中感染组TLR1/2/4/6/10含量高于对照组，感染组TLR3/9含量与对照组、感染组不同时段并无显著性差异；黑山羊TLR5、湖羊TLR7在感染组与对照组之间无明显差异。种内比较提示，TLRs能参与全身炎症的发生发展，不同品种羊在TLR5/7/8存在差异。5种羊TLR1/2/4/5/6在感染0h无显著性差异（P＞0.05），麻羊、波尔山羊和湖羊感染48h和96h血液样本TLR1基因含量显著高于黑山羊和白山羊（P＜0.01）；黑山羊和白山羊48和96h血液TLR2基因、黑山羊和白山羊96h血液TLR4基因含量极显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊（P＜0.01）；白山羊和波尔山羊96h血液TLR6基因极显著高于黑山羊、麻羊和湖羊。血液样本分析结果提示TLR1/2/4/6参与各品种羊全身性炎症过程，其中TLR1水平可能与实验羊血液炎症发生呈负相关，而TLR2/4/6与炎症发展呈正相关。 2.Mo感染不同品种羊TLRs转录水平差异性研究 应用TaqMan实时荧光定量检测方法对5种羊25份肺脏样本和126份血液样本TLR1-10转录水平检测分析。实验羊肺脏样本中TLRs基因转录水平分析显示，各种羊感染组肺脏组织中TLRs基因转录水平均显著高于对照组（P＜0.05）。黑山羊、白山羊肺组织中TLR1/2/4/5/6/8/9基因转录水平高于TLR3/7/10，而麻羊、波尔山羊、湖羊肺组织中TLR4/5/7/8基因转录水平高于TLR1/2/3/6/9/10。种内比较结果提示，TLRs转录水平与基因含量水平呈现相似结果，与炎症进程存在相关关系。不同种羊肺脏样本TLRs基因转录水平分析显示，黑山羊、白山羊肺组织中TLR1/2/9转录水平显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊（P＜0.05），白山羊肺组织中TLR6、湖羊肺组织中TLR4转录水平较其它品种羊最高（P＜0.01）；波尔山羊肺组织TLR5/7/10转录水平最高（P＜0.01）。种间比较结果提示，TLRs转录水平参与调控羊支原体炎症进程存在种间差异。 实验羊血液样本中TLR1-10转录水平分析显示，同种羊感染Mo48h和96h血液样本TLR1/2/4/6/7/8基因转录水平高于0h和对照组；麻羊、波尔山羊、湖羊感染组TLR3基因转录水平高于对照组；麻羊感染组TLR10转录水平显著高于对照组。种内比较结果，提示各品种TLR1/2/4/6/7/8普遍参与全身性炎症反应，而TLR3/5/9/10存在种间差异。各种羊感染组间各时段TLR5/9无显著差异；0h、48h感染组血液样本TLR1基因转录水平种间差异不显著（P＞0.05），湖羊96h血液中TLR1转录水平显著高于其余品种羊（P＜0.05）；黑山羊、白山羊、波尔山羊和湖羊感染组48h、96h时TLR4转录水平极显著高于麻羊（P＞0.01）；白山羊感染组48h和96h时TLR6转录水平极显著高于其余4种羊（P＜0.01）；白山羊、波尔山羊感染组不同时间TLR7基因转录水平均极显著高于黑山羊、麻羊和湖羊；白山羊和黑山羊感染组48h和96h时TLR8基因转录水平极显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊。种间比较结果提示TLR1在转录水平负调控炎症进程，TLR2/4/6/7/8转录参与调控炎症进程存在种间差异。 3.Mo感染不同品种羊TLRs MyD88通路因子转录水平差异性研究 应用TaqMan实时荧光定量检测方法对5种羊25份肺脏样本和126份血液样本进行TLRs MyD88通路因子转录水平检测分析。结果显示，5种羊感染组肺组织MyD88、TRAF6、NF-κB、FOS、JUN基因转录水平均极显著高于对照组（P＜0.01）；种间差异性分析显示，白山羊肺组织NF-κB基因转录水平极显著高于其余4种羊（P＜0.01）；黑山羊、白山羊肺组织FOS基因转录水平极显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊（P＜0.01）；JUN基因转录水平种间差异不显著（P＞0.05）。实验羊肺组织MyD88通路因子转录水平差异性分析提示，Mo感染可激活TLRs MyD88通路促进炎症反应，其中白山羊、黑山羊反应强烈。 血液样本MyD88、TRAF6、NF-кB、FOS、JUN基因转录水平差异性分析显示，5种羊感染组极显著高于对照组（P＜0.01），同时感染48、96h各基因转录水平均高于0h。黑山羊和白山羊感染组各时段MyD88、TRAF6、FOS转录水平均极显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊（P＜0.01）。5种羊感染组NF-κB基因转录水平0h-96h间持续升高，种间无显著性差异（P＞0.05）；5种羊感染组JUN基因各时段均差异不显著（P＜0.01）。血液样本MyD88通路因子转录水平差异性分析提示，Mo感染可激活TLRs MyD88通路促进炎症反应，5种羊TLRs/MyD88/NF-кB通路存在差异，以黑山羊、白山羊表现更为强烈。 4.Mo感染不同品种羊TLRs TRIF通路因子转录水平差异性研究 应用TaqMan实时荧光定量检测方法对5种羊25份肺脏样本和126份血液样本TLRs TRIF通路因子转录水平检测分析显示，5种羊感染组肺组织中TRIF、TRAF3、IRF3、IRF7极显著高于对照组（P＜0.01）；种间差异性分析显示，TRIF、TRAF3基因种间彼此差异显著（P＜0.05），麻羊肺组织IRF3基因转录水平最高（P＜0.01）；黑山羊、白山羊肺组织IRF7转录水平极显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊（P＜0.01）。TRIF通路因子转录水平差异性分析提示，Mo感染可启动羊TLRs TRIF信号通路，其中以黑山羊、白山羊最为明显。 5种羊感染组血液样本TRIF、IRF3、IRF7基因转录水平极显著高于对照组（P＜0.01），且感染48h和96h时转录水平均高于0h；种间差异性分析显示，黑山羊、白山羊感染组96h时TRIF基因转录水平极显著高于麻羊、波尔山羊、湖羊（P＜0.01）；麻羊感染组48h和96h时IRF3基因转录水平极显著高于黑山羊、白山羊、波尔山羊和湖羊（P＜0.01）；黑山羊、白山羊感染组48h、96h时IRF7转录水平极显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊。血液样本TRIF通路因子转录水平差异性分析提示，Mo感染激活TLRs TRIF通路，黑山羊、白山羊表现强烈。

目录

缩略词表

文献综述:羊肺炎支原体与Toll样受体信号通路研究进展

第一章 Mo感染不同品种羊TLRs基因水平差异性研究

1 材料

1.1 菌株和实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1不同品种羊Mo感染试验

2.2 TaqMan实时荧光PCR方法的建立

2.3 Mo感染羊TLRs基因定量检测与分析

3 结果

3.1 Mo感染羊样本采集结果

3.2 TaqMan荧光定量PCR方法建立结果

3.3 实验羊TLRs基因定量检测分析结果

4 讨论

4.1 关于羊支原体肺炎

4.2 关于基因定量分析技术

4.3 病原感染与TLRs相关关系

第二章 Mo感染不同品种羊TLRs转录水平差异性研究

1材料

1.1 样本

1.2 试剂

2 方法

2.1 引物合成

2.2 肺脏样本RNA提取

2.3 血液样本RNA提取

2.4 cDNA的合成

2.5 Mo感染羊TLRs基因转录水平定量检测与分析

3 结果

3.1 RNA样本质量评价结果

3.2 实验羊TLRs基因转录水平定量检测分析结果

4. 讨论

4.1 关于样本选择与实验平行设计

4.2 关于TLRs表达检测技术

4.3关于Toll样受体表达与支原体感染

第三章 Mo感染不同品种羊TLRs MyD88通路因子转录水平差异性研究

1.材料

2.方法

2.1 TLRs MyD88通路因子qPCR方法的建立

2.2 样本的检测与分析

3 结果

3.1 TaqMan荧光定量PCR方法建立结果

3.2实验羊肺脏和血液样本TLRs MyD88通路因子转录水平检测

4 讨论

4.1 关于TLRs MyD88信号通路及其接头分子

4.2 关于TLRs信号通路因子与炎症关系

4.3 关于动物品种与TLRs及其信号通路关系

第四章 Mo感染不同品种羊TLRs TRIF通路因子转录水平差异性研究

1.材料

2.方法

2.1 TLRs TRIF通路因子qPCR检测方法的建立

2.2 样本的检测与分析

3 结果

3.1 TaqMan荧光定量PCR方法建立结果

3.2. 实验羊TLRs TRIF通路因子在肺脏和血液中转录水平检测结果

4讨论

4.1 关于Toll样受体TRIF信号通路及其接头因子

4.2 关于Toll样受体信号通路与机体免疫的关系

4.3 关于TLRs及其信号通路与不同品种羊支原体肺炎易感相关性

全文结论

参考文献

致谢

附录

声明