天麻提取物对灰树花胞外多糖理化特性、抗氧化及免疫活性影响的探究

摘要

本文主要开展了天麻提取物对灰树花胞外多糖组分、理化特性、结构特点和生物活性等方面的研究。研究内容主要包括：添加7%（v/v）天麻提取物参与灰树花发酵过程中，确定天麻提取物的主要成分及其含量的变化，探究天麻提取物对灰树花胞外多糖组分排布及含量的影响；以多糖主要组分为研究对象（EPS-2和REPS-2），确定多糖组分间多糖含量、蛋白质含量、糖醛酸含量，分子量、单糖组成和糖苷键键合等方面的差异，探究天麻提取物对灰树花胞外多糖结构特点的影响；以体外抗氧化和小鼠体内免疫实验为研究目标，确定多糖组分间对超氧阴离子自由基清除率、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、小鼠免疫器官指数、血清免疫因子和血清免疫球蛋白含量的变化，探究天麻提取物对灰树花胞外多糖生物活性的影响，总结多糖结构特点与生物活性差异的关联。研究结果如下： 研究并建立了天麻素、对羟基苯甲醇（HA）、对羟基苯甲醛（HBA）和巴利森甙定性和定量的检测方法，分析了高温高压灭菌前后天麻提取物主要成分含量的变化及灰树花对天麻提取物主要成分的利用率。结果表明，经高温高压灭菌后，天麻提取物主要成分会发生改变，其中灭菌后的天麻提取物中天麻素含量增加了66.06%，HA含量增加了36.96%，HBA减少了37.64%，巴利森甙含量减少了90.47%；在灰树花发酵过程中，天麻提取物主要成分发生改变，其中天麻素含量降低了24.68%，HA含量提高了6.50%，HBA含量降低了42.59%且巴利森甙含量提高了9.85%； 在灰树花发酵过程中分别加入天麻提取物，对所得的胞外多糖组分EPS-2和REPS-2进行理化特性及结构特点检测。结果表明，EPS-2和REPS-2多糖含量分别为82.68%和84.12%，蛋白质含量分别为0.31%和0.23%，且二者均不含有糖醛酸；此外，EPS-2和REPS-2的分子量分别为1.295×104Da和2.904×104Da；EPS-2主要由葡萄糖，甘露糖和半乳糖组成，单糖摩尔比约为4.11∶4.68∶0.04，REPS-2主要由葡萄糖，甘露糖，半乳糖和岩藻糖组成，单糖摩尔比约为3.02∶5.72∶0.09∶0.16且二种均具有典型的多糖吸收峰；GC-MS甲基化表明EPS-2和REPS-2均含有t-Glcp、t-Manp、1,2-Glcp，1,3-Manp，1,6-Manp和1,3,6-Manp等六种不同类型的糖苷键，其中EPS-2主要含有t-Glcp，1,2-Glcp，1,3-Manp，1,6-Manp与1,3,6-Manp,摩尔比约为13.9∶23.5∶8.6∶26.8∶10.2，而REPS-2主要含有t-Manp，1,2-Glcp，1,3-Manp，1,6-Manp与1,3,6-Manp,其摩尔比约为10.5∶19.7∶9.2∶32.1∶14.5； 体外抗氧化实验结果表明，多糖EPS-2和REPS-2均有较好的抗氧化能力（超氧阴离子自由基清除率、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率），其中自由基清除率随多糖浓度的增加而增大，呈现明显的浓度依赖性，但均低于阳性对照Vc组；此外，添加天麻提取物的多糖组分REPS-2对DPPH自由基清除率作用效果最明显，其次是ABTS自由基，最后是超氧阴离子自由基，但清除效果均显著高于EPS-2（P＜0.05）且二者的半抑制浓度（ED50）均小于4mg/mL； 小鼠体内免疫活性实验结果表明，灌胃剂量为中剂量（100mg/kg）和高剂量（200mg/kg）的多糖EPS-2和REPS-2能够有效的促进由环磷酰胺（CTX）诱导的免疫缺陷小鼠体内胸腺指数，脾脏指数，血清细胞因子和免疫球蛋白含量显著增加（P＜0.05）；相同灌胃剂量下，添加天麻提取物的多糖组分REPS-2在促进血清免疫因子（IFN-γ和IL-2）和免疫球蛋白（IgG）含量方面显著高于EPS-2（P＜0.05）。所以，以甘露聚糖/葡聚糖为主的REPS-2较EPS-2而言对小鼠免疫活性调节效果更明显。

目录

第一章 绪论

1.1 灰树花多糖的研究

1.2 多糖分析方法的研究进展

1.2.1 多糖的结构及表征

1.2.2 多糖分子量（纯度）

1.2.3 多糖的单糖组成

1.2.4 化学结构

1.3 多糖的生物活性

1.3.1 抗氧化作用

1.3.2 抗肿瘤作用

1.3.3 免疫调节作用

1.3.4 其他生物活性作用

1.4 多糖分子量、结构特点及生物学活性的关联

1.5 本论文研究基础及立题意义

1.6 本论文研究的主要内容

第二章 天麻提取物对灰树花胞外多糖组分分布及含量变化的探究

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 灰树花菌种

2.2.2 实验药品

2.2.3 实验仪器与设备

2.3 实验方法

2.3.1 培养基

2.3.2 培养方法

2.3.3 天麻提取物的制备

2.3.4 天麻提取物及主要成分的检测

2.3.5 DEAE-52预处理

2.3.6 Sephadex G-100预处理

2.3.7 胞外多糖的分离纯化

2.3.8 多糖含量的测定

2.3.9 蛋白质含量的测定

2.4.0 糖醛酸含量的测定

2.4.1 统计方法

2.5 结果与讨论

2.5.1 天麻素标准曲线

2.5.2 对羟基苯甲醇标准曲线

2.5.3 对羟基苯甲醛标准曲线

2.5.4 巴利森甙标准曲线

2.5.5 天麻提取物主要成分的定性测定

2.5.6 天麻提取物灭菌前后主要成分含量的变化

2.5.7 灰树花发酵过程中天麻提取物含量变化

2.5.8 灰树花胞外多糖（对照组）组分研究

2.5.9 灰树花胞外多糖（实验组）组分研究

2.6.0 多糖含量的测定

2.6.1 蛋白质含量的测定

2.6.2 糖醛酸含量的测定

2.7 本章小结

第三章 灰树花多糖结构解析

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 菌种与天麻种类

3.2.2 实验药品

3.2.3 实验仪器与设备

3.3 实验方法

3.3.1 培养基

3.3.2 培养方法

3.3.3 天麻提取物的制备

3.3.4 灰树花多糖的制备

3.3.5 多糖分子量测定

3.3.6 单糖组成的测定

3.3.7 傅里叶红外光谱测定

3.3.8 GC-MS甲基化测定

3.3.9 统计方法

3.4 结果与讨论

3.4.1 灰树花多糖EPS-2和REPS-2的分子量

3.4.2 单糖混合标准品高效阴离子色谱图

3.4.3 灰树花胞外多糖单糖组成分析

3.4.4 傅里叶红外光谱图

3.4.5 GC-MS甲基化分析

3.5 本章小结

第四章 灰树花多糖影响体外抗氧化活性的研究

4.1 前言

4.2 实验材料

4.2.1 菌种与天麻

4.2.2 实验药品

4.2.3 实验仪器与设备

4.3 实验方法

4.3.1 培养基

4.3.2 培养方法

4.3.3 天麻提取物的制备

4.3.4 灰树花多糖的制备

4.3.5 超氧阴离子自由基的测定

4.3.6 DPPH自由基的测定

4.3.7 ABTS自由基的测定

4.3.8 统计分析

4.4 结果与讨论

4.4.1 超氧阴离子自由基的测定

4.4.2 DPPH自由基的测定

4.4.3 ABTS自由基的测定

4.5 本章小结

第五章 灰树花多糖影响小鼠免疫活性的研究

5.1 前言

5.2 实验材料

5.2.1 菌种与天麻

5.2.2 实验药品

5.2.3 实验仪器与设备

5.3 实验方法

5.3.1 培养基

5.3.2 培养方法

5.3.3 天麻提取物的制备

5.3.4 灰树花多糖的制备

5.3.5 小鼠的喂养

5.3.6 免疫缺陷型小鼠模型的构建

5.3.7 胸腺和脾脏指数的测定

5.3.8 小鼠血清免疫因子和免疫球蛋白的测定

5.3.9 统计分析

5.4 结果与讨论

5.4.1 灰树花多糖对免疫缺陷小鼠免疫器官指数的影响

5.4.2 灰树花多糖对免疫缺陷小鼠血清免疫因子TNF-α和IFN-γ含量的影响

5.4.3 灰树花多糖对免疫缺陷小鼠血清免疫因子IL-2和IL-6含量的影响

5.4.4 灰树花多糖对免疫缺陷小鼠血清免疫球蛋白IgG和IgA含量的测定

5.5 本章小结

第六章 总结与展望

6.1 主要结论

6.2 论文创新点

6.3 展望

致谢

参考文献

研究生期间发表论文清单

附录

声明