基于乳酸菌发酵对猪肉中N-羟乙酰神经氨酸降解效果的研究

摘要

非人源唾液酸N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）通过红肉及其加工制品进入人体富集导致免疫原性炎症继而促进肿瘤生长引发各种疾病问题。发酵红肉制品作为传统的加工肉类产品，广受消费者喜爱，其安全性也倍受关注。发酵红肉制品中最主要的优势菌种乳酸菌，能够分解碳水化合物产生乳酸，降低红肉pH值，且具有强大的功能特性。有研究证明，Neu5Gc是具有9碳骨架的酸性糖类能够被细菌当作碳源利用，并且酸性条件下结构不稳定容易被强酸破坏，因此验证乳酸菌对Neu5Gc是否具有降解作用，探索乳酸菌发酵肉制品对Neu5Gc降解的研究及发酵控制手段可为发酵肉制品的安全价值提供理论基础。本文据此开展了基于乳酸菌发酵对猪肉中N-羟乙酰神经氨酸降解效果的研究。 （1）发酵红肉制品中Neu5Gc高效液相色谱-荧光检测方法的建立 通过前处理优化确认以2mol/L冰乙酸释放试样中的Neu5Gc，DMB为衍生化试剂，并采用安捷伦ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(150mm×4.6mm×5μm)，甲醇∶超纯水＝20∶80为流动相，流速0.9mL/min，荧光检测器激发波长373nm，发射波长448nm等系列条件的HPLC-FLD分析检测方法。该方法经验证：Neu5Gc在25～400μmol/L范围内与Neu5Gc峰面积的线性关系良好，R2＝0.99941；样品加标平均回收率在96.4%～99.07%之间；精密度的相对标准偏差RSD为1.2％，重复性的RSD为1.5％；LOD为0.001μmol/L，LOQ为0.003μmol/L。检测发酵红肉样品中Neu5Gc的含量在9.59～20.08μg/g之间，不同的发酵红肉制品Neu5Gc的含量之间均存在显著性差异（P＜0.05）。本方法能有效分离Neu5Gc目标峰(分离度R＞1.5)、操作简单、重复性好、灵敏度和精密度高，可广泛用于发酵红肉制品中Neu5Gc的含量测定。 （2）乳酸菌降解Neu5Gc的降解特性研究 搭建简单发酵体系研究pH、顶层空气含量、接菌量等不同培养条件下GDM1.919植物乳杆菌、GIM1.774肠膜明串珠菌、G1M11.294清酒乳杆菌清酒亚种和GDM1.895木糖葡萄球菌4株乳酸菌对Neu5Gc的降解特性，实验结果表明：除GIM1.774肠膜明串珠菌外其他菌株在接种量不同条件下对Neu5Gc的降解无显著差异；pH对四株乳酸菌降解Neu5Gc均有显著影响，随着培养基中pH值的降低，4株菌对Neu5Gc的降解率均呈先增大后减小的趋势；通过控氧发酵可知，顶层空气体积为发酵液体积的2~3倍时对Neu5Gc的降解率最高。使用一级动力学方程对四株乳酸菌每隔12h发酵时间下Neu5Gc的残留浓度进行线性拟合，通过对比降解速率k值得出GDM1.919植物乳杆菌具有最强的降解能力，降解速率k为0.041，半衰期t1/2=6.08h。 （3）GDM1.919植物乳杆菌在发酵猪肉制品中的应用及分子机制探究 从4株乳酸菌中优选出GDM1.919植物乳杆菌作为发酵剂接种到猪肉中发酵，以自然发酵作为对照组。动态监测Neu5Gc和Neu5Ac的含量变化，研究乳酸菌发酵过程中对降低Neu5Gc免疫原性风险的影响。实验证明：随着发酵时间的延长Neu5Gc含量逐渐减小，实验组的降低趋势显著大于对照组（P＜0.05），12h后对照组Neu5Gc检测含量开始上升，实验组在24h后Neu5Gc检测含量也呈现上升趋势。但是在各个时间点实验组的Neu5Gc的含量均显著低于对照组（P＜0.05），且从整体上来看，发酵过后Neu5Gc的含量仍然低于原材料中Neu5Gc的含量，对于降低发酵红肉制品中Neu5Gc免疫原性风险具有实际意义。 通过对发酵过程中常见的两种中间产物（乙醇和乳酸）与Neu5Gc所有羟基相互作用产生的复合物分子间相互作用进行分析表明，乳酸比乙醇更加易于和Neu5Gc相互作用，溶剂下最低结合能分别为-44.18和-79.30kcal/mol。独立密度梯度理论分析表明：乙醇和Neu5Gc可产生七个分子间氢键，乳酸和Neu5Gc可产生十五个分子间氢键。分子力场能量分解表明：结合过程主要由静电相互作用主导，其中乙醇-Neu5Gc相互作用的静电作用为-305.51kJ/mol，乳酸-Neu5Gc复合物相互作的静电作用为-538.74kJ/mol。

目录

缩略词表

第一章 绪论

1 Neu5Gc唾液酸结构及其理化性质

1.1 唾液酸及Neu5Gc

1.2 Neu5Gc 的生物合成

2 Neu5Gc检测方法的研究进展

2.1 Neu5Gc检测的前处理

2.2 Neu5Gc的检测方法

3 红肉中Neu5Gc与人类疾病的关系

3.1 人体的Neu5Gc来源及代谢途径

3.2 红肉中Neu5Gc与癌症的关系

4 降低Neu5Gc免疫原性风险研究进展

4.1 原料生产环节

4.2 红肉加工环节

4.3 微生物可能存在的Neu5Gc降解机制

4.4 基于计算化学方法的Neu5Ac解离分子机制探究

5 研究的意义及主要内容

第二章 发酵红肉制品中Neu5Gc高效液相色谱-荧光检测方法的建立

前言

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

1.2 仪器与设备

2 实验方法

2.1 试剂溶液配制

2.2 样品前处理优化

2.3 衍生剂的配制及衍生反应

2.4 高效液相色谱条件的优化

2.5 HPLC-FLD方法学验证

2.6 不同发酵制品中Neu5Gc的含量测定

2.7 统计分析方法

3 结果与分析

3.1 色谱柱及流动相的确定

3.2 样品前处理条件优化

3.3 HPLC-FLD方法学验证

3.4 不同发酵制品中Neu5Gc的含量测定

4 本章小结

第三章 乳酸菌降解Neu5Gc的降解特性研究

前言

1 材料与设备

1.1 实验菌株

1.2 培养基

1.3 实验试剂

1.4 仪器与设备

2 实验方法

2.1 菌株的活化

2.2 种子液的制备

2.3 生长曲线及的测定

2.4 产酸曲线的测定

2.5 高效液相色谱条件

2.6 脱脂乳培养基回收率测定

2.7 唾液酸降解率的计算

2.8 接种量对乳酸菌降解Neu5Gc的影响

2.9 pH对乳酸菌降解Neu5Gc的影响

2.10 顶层空气体积对乳酸菌降解Neu5Gc的影响

2.11 四株乳酸菌的降解动力学研究

2.12 统计分析方法

3 结果与分析

3.1 生长曲线的测定

3.2 四株乳酸菌产酸能力测定

3.3 脱脂乳培养基回收率测定

3.4 pH对乳酸菌降解Neu5Gc的影响

3.5 接种量对乳酸菌降解Neu5Gc的影响

3.6 顶层空气体积对乳酸菌降解Neu5Gc的影响

3.7 降解动力学模型建立

4 本章小结

第四章 GDM1.919植物乳杆菌在发酵猪肉制品中的应用及分子机制探究

前言

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

1.2 仪器与设备

2 实验方法

2.1 发酵方式

2.2 发酵红肉制品理化指标测定

2.3 发酵过程中Neu5Gc和Neu5Ac含量的变化

2.4 发酵环境下Neu5Gc的反应活性研究

2.5 统计分析方法

3 结果与分析

3.1 发酵红肉制品理化指标测定

3.2 发酵过程中Neu5Gc和Neu5Ac含量的变化

3.3 发酵环境下Neu5Gc的反应活性研究

4 本章小结

总结与展望

参考文献

致谢

在读期间科研情况

声明