鸭瘟病毒感染对鸭肠道菌群结构的影响

摘要

鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)又称鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)，可引起鸭、鹅以及雁形目禽类发生一种急性败血性高度接触性传染病(即鸭病毒性肠炎，DEV)，是目前严重威胁养鸭业发展的重要病原之一。目前，国内外学者对DPV开展多方面深入研究，但主要集中在病毒形态结构、侵染过程及分子检测等方面，很少涉及到病毒感染与肠道菌群相关性研究，而肠道菌群作为诱导动物肠道黏膜免疫应答的重要组成部分，对维护和保障动物健康具有十分重要的作用。为此，本研究采用先进Illumina Hiseq2500高通量测序技术开展DPV感染对鸭肠道菌群结构影响分析，以期为DPV感染的预防与控制提供科学依据。 选取35日龄健康樱桃谷鸭，随机分成2组即对照组和感染组；感染组鸭腿部肌注0.1mL DPV-GZ株病毒液，于接种后24h、48h、72h、96h和120h时捕杀，5只/(组※时间段)，正常组肌注灭菌生理盐水，于接种后24h时捕杀，采集肝脏、脾脏、脑和肠内容物样本，提取病毒DNA，采用DPV-NP基因荧光定量PCR方法检测病毒含量；同时采集上述时间段实验鸭肠内容物，送至广州基迪奥生物科技有限公司进行16S rDNA V3~V4高变区高通量测序，采用生物信息学软件进行分析，获得的主要研究结果如下： 1．DPV感染鸭肠道细菌群落结构变化：DPV感染后24h即可在鸭肝脏和脾脏中检测到DPV，到48h鸭各个组织均可检出；经Alpha指数分析显示，随着DPV感染时间延长即病毒含量增加，鸭肠道细菌群落的丰度和多样性指数(Chao1、ACE、Shannon和Simpson)呈现先上升后下降趋势；经菌群结构差异显著性分析显示，感染组鸭肠道菌群结构在感染24h时与正常组的差异无显著性，在感染48h和72h时呈差异显著，在感染96h和120h时呈差异极显著。这说明DPV感染可导致鸭肠道菌群结构改变。 2．DPV感染鸭肠道细菌群落丰度变化：经细菌种别分析显示，DPV感染对鸭肠道的菌落相对丰度产生一定的影响，其中：在门水平上，厚壁菌门为先升高后下降，梭杆菌门和拟杆菌门升高，变形菌门下降；在纲水平上，梭菌纲呈先升高后下降，拟杆菌纲和梭杆菌纲升高，丙型变形菌纲、丹毒丝菌纲和芽孢杆纲下降；在目水平上，梭菌目和月牙单胞菌呈先升高后下降，拟杆菌目和梭杆菌目升高，肠杆菌目、丹毒丝菌目和乳杆菌目下降；在科水平上，拟杆菌科、梭杆菌科和瘤胃菌科升高，消化链球菌科和理研菌科先升高后下降，肠杆菌科和丹毒丝菌科下降；在属水平上，梭杆菌属和拟杆菌属升高，大肠杆菌志贺菌亚属和分节丝状菌属下降，另枝菌属、巨单胞菌属、Turicibacter和粪杆菌属先升高后下降；在种水平上，产气荚膜梭菌和死亡梭杆菌升高。 3．DPV感染鸭肠道主要差异细菌群落：经LEFse分析显示，主要差异细菌群落为：变形菌门、丙型变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科和大肠杆菌志贺菌亚属，芽孢杆菌纲、乳杆菌目；梭杆菌门、梭杆菌纲、梭杆菌目、梭杆菌科、梭杆菌属，弯曲菌目、弯曲菌科、弓形杆菌属，产气荚膜梭菌。 综上所述，DPV感染可导致鸭肠道菌群结构发生改变，且感染时间延长，鸭肠道菌群差异越显著。这些研究结果提示，可通过维持和稳定鸭肠道菌群结构，来预防和控制鸭瘟病程的发生与发展。

目录

缩略词

文献综述:肠道菌群检测方法的概述

1 肠道菌群检测方法

1.1传统分离培养法

1.2传统分子生物学技术

1.3新一代分子生物学技术

2 研究目的与意义

1 材料

1.1 实验动物

1.2 实验毒株

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器

2 方法

2.1 DPV人工感染及样品采集

2.2 感染鸭不同组织DPV含量检测

2.2.1 病毒DNA提取

2.2.2 病毒qPCR检测分析

2.3 DPV感染鸭肠道菌群16S rDNA 测序

2.3.1 肠内容物DNA提取

2.3.2 鸭肠道菌群16S rDNA扩增及文库构建

2.3.3 文库定量及测序

2.4 DPV感染鸭肠道菌群测序数据处理分析

2.4.1 测序数据质量控制和序列拼接

2.4.2 肠道菌群OTU聚类分析

2.4.3肠道菌群多样性分析

2.4.4 肠道菌群物种分类分析

3 结果

3.1感染鸭不同组织DPV含量检测结果

3.2 DPV感染鸭肠道菌群16S rDNA扩增结果

3.3 DPV感染鸭肠道菌群测序数据质量控制

3.4 DPV感染鸭肠道菌群OTU分析

3.4.1 肠道菌群OTU聚类

3.4.2 肠道菌群OTU比较分析

3.5 DPV感染鸭肠道菌群多样性分析

3.5.1肠道菌群Alpha多样性分析

3.5.2 肠道菌群Beta多样性分析

3.6 DPV感染鸭肠道菌群物种分类分析

3.6.1肠道菌群不同分类水平的变化分析

3.6.2 肠道菌群总体水平物种差异分析

4 讨论

4.1 鸭肠道菌群多样性对比分析

4.2 DPV感染鸭肠道菌群结构变化分析

4.3 肠道菌群高通量测序方法的评价

全文结论

参考文献

附录

致谢

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