家鸭人工感染鸭瘟强毒株的动态分布、黏膜免疫及对肠道菌群结构的影响

摘要

鸭瘟(DuckPlague，DP)又称鸭病毒性肠炎(DuckViralEnteritis，DVE)，是由鸭瘟病毒(DuckPlagueVirus，DPV)引起的常见于鸭、鹅等雁行目禽类的一种急性败血性的接触性传染病。黏膜免疫是指发生在机体与外界相通腔道黏膜表面的免疫。黏膜免疫系统(Mucosalimmunesystem，MIS)是在一定程度上独立存在于系统免疫系统之外的免疫系统，能对某些病原微生物产生有效的免疫，同时对绝大部分来自外界的无害物质或营养物质产生免疫耐受，是机体抵抗病原微生物通过黏膜入侵的重要防线。本研究对DPV强毒经不同途径感染鸭的呼吸道和消化道等局部黏膜免疫的发生和变化规律进行了检测、应用ERIC-PCR技术对肠道菌群结构的多样性和动态变化进行了初步研究和分析，获得以下系列结果： 1.分别采用饱和硫酸铵沉淀法和不同浓度聚乙二醇PEG-6000沉淀法从鸭胆汁中粗提IgA，经Micro-PrepS离子交换介质纯化后，通过SDS-PAGE和ELISA检测纯度和活性。结果表明：终浓度15％的PEG-6000沉淀可从鸭胆汁中获得电泳纯的IgA，其产量最高，活性最好；经终浓度22％PEG-6000和饱和硫酸铵沉淀，Micro-PrepS离子交换介质纯化所得IgA，其产量和活性均明显下降。将纯化后的IgA免疫兔，获得了高效价的兔抗鸭IgA血清，结合辛酸-硫酸铵法粗提和离子交换层析纯化，获得了纯度较高的兔抗鸭IgA的IgG。 2.结合硫酸铵沉淀和Sepharose4B分子筛层析法，从鸭富集IgM血清中，分离纯化IgM。经SDS-PAGE电泳、琼脂扩散和2-巯基乙醇试验分析，结果显示：硫酸铵沉淀的免疫球蛋白经Sepharose4B分子筛层析后，第一个蛋白洗脱峰为达电泳纯的IgM。采用与上一章相同的方法，获得了达电泳纯的兔抗鸭IgM的IgG。 3.应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR对DPV强毒经皮下、口服、滴鼻和同居感染20日龄鸭后，在鸭体内的增殖分布规律进行检测。结果表明：DPV分布到各组织器官的速度与感染的途径和鸭的解剖结构密切相关，皮下注射是DPV分布到各组织器官速度最快的途径。DPV经皮下、口服和滴鼻感染鸭后，能在30min内通过血液首先到达离感染部位最近的免疫器官繁殖，鸭免疫器官抗DPV感染的重要性依次是脾脏、胸腺、法氏囊和哈德氏腺。肠道尤其是盲肠和回盲处是DPV感染机体后期，病毒增殖最快的部位。DPV分布到免疫器官和肠道的速度和数量决定了DPV感染的潜伏期和疾病的严重程度。DPV致死鸭的法氏囊和肾是DPV-DNA含量最高的实质器官。 4.通过本实验建立的DPV特异性SIgA、IgG和IgM间接ELISA检测方法，对DPV强毒经不同途径感染20日龄鸭后，鸭血液、胆汁、呼吸道和消化道分泌液中的DPV特异性SIgA、IgG和IgM的消长规律进行了监测。结果表明：除皮下攻毒鸭外，均可在其它感染鸭上呼吸道和消化道分泌液中检测到SIgA，且抗体滴度最高，维持时间最长，SIgA是鸭MIS抗DPV感染的主要体液免疫因子，上呼吸道和消化道是鸭MIS的重要组成部分。IgM在所有受检体液中检出时间最早，是机体抗DPV感染早期的主要抗体。IgG在血清中的抗体滴度最高，维持时间较长，是系统免疫的主要体液免疫因子，DPV经呼吸道和消化道感染鸭后，能同时激活MIS和系统免疫系统。胆汁中抗DPV特异性SIgA的抗体滴度较呼吸道和消化道分泌液中SIgA的抗体滴度高。 5.建立了IgA生成细胞的间接免疫过氧化物酶组织化学染色检测法(IISM)，该法具有特异性好、敏感性高的优点。应用该法对20日龄不同途径感染DPV强毒鸭的消化道、呼吸道和主要免疫器官石蜡切片中IgA生成细胞的变化规律进行检测。结果显示：除DPV皮下感染鸭各组织器官中IgA生成细胞数量下降或变化不明显外，其它组鸭肠道黏膜固有层尤其是十二指肠黏膜固有层中的IgA生成细胞较正常鸭明显增加，鸭黏膜固有层是鸭黏膜免疫最大的效应位点，十二指肠黏膜固有层是肠相关淋巴组织(GALT)的主要效应位点。口服感染鸭消化道IgA生成细胞数量出现增加的时间较滴鼻感染鸭早，数量多；而滴鼻感染鸭呼吸道IgA生成细胞增加的时间早于口服感染鸭，达到高峰的时间要比口服感染鸭早3d，鸭既存在局部黏膜免疫系统，又存在共同黏膜免疫系统(CMIS)。口服和滴鼻感染鸭的法氏囊、脾脏和哈德氏腺中IgA生成细胞数量都有不同程度的增加。 6.本研究成功建立了具有良好特异性和敏感性的CD3+细胞和DPV顺序间接免疫过氧化物酶检测方法。应用该法同时对DPV强毒经不同途径感染20日龄鸭的消化道、呼吸道和主要免疫器官石蜡切片中CD3+细胞和DPV进行检测。结果表明：不同途径感染鸭的消化道、呼吸道和免疫器官的黏膜上皮细胞中均可在攻毒后1d-3d检测到DPV，其中肠道黏膜上皮细胞(IEC)是DPV最早侵噬的靶细胞之一。消化道中DPV与CD3+细胞的增殖规律具有一定的相关性。DPV皮下感染鸭的消化道和呼吸道黏膜固有层的CD3+细胞浆中可见DPV阳性染色。脾脏淋巴细胞、法氏囊黏膜上皮细胞(皮质和髓质的淋巴细胞)、哈德氏腺腺泡上皮淋巴细胞均可见DPV阳性染色，且CD3+细胞浆中也可见DPV阳性染色。同一时间段脾脏、胸腺、法氏囊和哈德氏腺中CD3+细胞数量依次降低。 7.建立了分析鸭肠道菌群结构的ERIC-PCR方法，并应用其对DPV强毒株经不同途径感染20日龄鸭各肠段中细菌菌群结构的多样性和动态变化进行检测。结果表明：正常鸭肠道内的菌群结构相对稳定，其中十二指肠和空肠的ERIC-PCR条带最少，盲肠最多。DPV感染鸭肠道菌群失调的程度与DPV感染途径密切相关，以皮下感染鸭最为明显，其它组依次是皮下感染同居鸭、口服感染及其同居鸭，而滴鼻感染及其同居鸭没有明显变化。需氧菌或兼性厌氧菌(大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌等)成为皮下和口服感染及其同居鸭的优势菌群。口服感染鸭的回肠中的一个未知菌成为优势菌。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写

论文独创性声明及关于论文使用授权的声明

文献综述第一章动物黏膜免疫系统研究进展

文献综述第二章ERIC-PCR在胃肠道菌群结构多样性及种群结构研究中的应用

实验研究第三章鸭胆汁中IgA的分离纯化及兔抗鸭IgA的IgG制备

实验研究第四章鸭血清中IgM的分离纯化及兔抗鸭IgM的IgG制备

实验研究第五章基于TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR对DPV强毒不同途径感染鸭体内增殖分布规律的研究

实验研究第六章鸭不同途径感染DPV强毒与局部黏膜及外周血中抗DPV特异性SIgA、IgG和IgM发生关系的研究

实验研究第七章鸭不同途感染DPV强毒与局部黏膜组织及免疫器官中IgA生成细胞动态分布关系的研究

实验研究第八第DPV强毒感染鸭局部黏膜组织和免疫器官中DPV和CD3+细胞水平变化的研究

实验研究第九章DPV强毒感染鸭肠道菌群结构变化特征的初步分子解析

结论

参考文献

附图和附表

致谢

作者简介