趋化因子配体18基因与卵巢肿瘤的关系研究

摘要

卵巢恶性肿瘤以其发病隐匿、症状不明显、进展迅速、早期发现率低以及生物学特性错综复杂，加之术后易复发，5年生存率徘徊在25％至30％，而成为目前女性生殖器恶性肿瘤中威胁最大的疾病。目前CA125在临床上得到广泛应用，但临床实践表明单一指标对于早期卵巢癌的诊断特异性、敏感性仅能达到25～30％，各种新的肿瘤标志物仍然无法替代CA125的诊断效果。而各种影像学检查和外科手术存在费用高、创伤大等缺点，对于早期卵巢恶性肿瘤妇女诊断率低。故寻找一种更加可信的肿瘤标志物，以提高临床早期诊断率，改善患者预后已成为急需。 趋化因子配体18是一种炎性趋化性小分子分泌蛋白，但新近的研究表明，CCL18可以起着局部抗肿瘤免疫调节因子的作用，从而影响肿瘤的浸润、转移等生物学行为及患者的预后。本研究是在课题组先期使用表面增强激光解吸离子化-飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)结合IMAC-Cu和WCX-2蛋白质芯片分析卵巢恶性肿瘤患者与卵巢良性病变患者和健康人血清差异蛋白表达谱，筛选出31个潜在血清标志物蛋白，其中被鉴定为CCL18的标志蛋白对卵巢恶性肿瘤临床判断具有重要意义[1]的基础上，进一步探讨趋化因子配体18在卵巢恶性肿瘤组织中的表达及其在卵巢恶性肿瘤的发生发展中的作用。 本研究通过分子生物学技术及体外细胞实验对CCL18与人卵巢癌的发生发展的关系进行了研究，取得以下学术进展： 1、通过用实时荧光定量PCR的方法检测31例卵巢恶性肿瘤组织、14例良性卵巢肿瘤组织及14例正常卵巢组织中CCL18的表达量，发现CCL18在卵巢恶性肿瘤组织中的阳性表达率和表达量明显高于良性和正常卵巢组织(p<0.05)；分析CCL18的表达量与卵巢恶性肿瘤的临床病理及预后联系，结果均无明显相关。 2、通过基因工程技术，构建PETSUMO-CCL18原核表达质粒，并表达、纯化获得趋化因子配体18的重组成熟肽段。进一步将此肽段作为标准品，使用LCM联合免疫磁珠及MALDI-TOF检测不同卵巢上皮细胞中CCL18蛋白表达情况，发现卵巢恶性肿瘤上皮细胞确实表达CCL18蛋白，且表达阳性率高(9/10)，良性卵巢上皮细胞中CCL18表达率50％，正常卵巢上皮细胞无明显CCL18蛋白表达。 3、检测各种体外培养的卵巢上皮癌细胞株发现有CCL18基因的表达。构建CCL18真核表达载体，并通过体外实验了解CCL18过表达对卵巢癌细胞浸润转移过程中的作用。流式细胞仪检测显示SKOV3-CCL18组处于增殖状态(S+G2+M)的细胞为32.8％，较对照组明显增加(p<0.05)；CCL18组和对照组的生长曲线无明显区别；SKOV3细胞在转染前后的侵袭能力、粘附能力及迁移能力均有明显增加(p<0.05)。 4、构建CCL18的RNAi真核载体，转染卵巢上皮癌细胞株SKOV3后测定细胞功能，细胞生长曲线显示干扰组细胞倍增时间无明显变化；干扰组细胞周期中处于增殖状态(S+G2+M)的细胞明显减少；侵袭、迁移、粘附实验均发现干扰组细胞有明显降低，差异有统计学意义(p<0.05)。 总之，本研究在体外培养的卵巢上皮癌细胞及冰冻切片的卵巢上皮癌细胞中均发现有CCL18表达，且其在卵巢恶性肿瘤中的表达明显高于卵巢良性肿瘤及正常卵巢，体外细胞学实验表明CCL18对卵巢上皮癌细胞的浸润转移也有明显相关。表明CCL18有潜力成为卵巢上皮癌的早期诊断标志物和分子靶点。

目录

文摘

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声明

第一章 卵巢肿瘤血清诊断标志物筛选及临床验证研究近况(文献综述)

1卵巢恶性肿瘤概述

1.1卵巢恶性肿瘤的发病率及可能的致病因素

1.2卵巢恶性肿瘤的主要诊断与鉴别诊断模式及存在的问题

2、卵巢肿瘤血清诊断标志物研究近况

2.1血清抗原抗体类诊断标记物

2.2激素类标志物

2.3酶类标志物

2.4肽类标志物

2.5多指标联合应用的应用价值

3、卵巢恶性肿瘤的分子诊断及判断预后的研究现况

3.1癌基因检测作为卵巢恶性肿瘤诊断及判断预后的临床价值

3.2抑癌基因检测作为卵巢恶性肿瘤诊断及判断预后的临床价值

3.3生长因子检测作为卵巢恶性肿瘤诊断及判断预后的临床价值

3.4细胞DNA及RNA含量检测的临床价值

3.5多分子指标联合应用的临床价值

4卵巢肿瘤血清潜在诊断标志物筛选及临床验证研究近况

4.1血清潜在诊断标志物筛选的主要方法及原理

4.2卵巢肿瘤血清潜在诊断标志物筛选现况

4.3已筛选出的卵巢肿瘤血清潜在诊断标志物临床验证现况

5、趋化因子配体18基因与卵巢肿瘤的关系研究

5.1 趋化因子配体18基因概述

5.2 趋化因子配体18基因与恶性肿瘤的关系研究

5.3 趋化因子配体18基因与卵巢恶性肿瘤的关系研究

5.4 趋化因子配体18基因在卵巢恶性肿瘤诊断、鉴别诊断中的可能价值

6 本研究的目地和意义

参考文献

第二章趋化因子配体18基因在卵巢恶性肿瘤组织中的表达及临床意义

1材料与方法

1.1临床资料

1.2主要试剂及配制

1.3引物设计与合成

1.4实验方法

2结果

2.1卵巢肿瘤组织中CCL18基因mRNA表达的RT-PCR条件建立

2.2趋化因子配体18的荧光定量PCR条件建立

2.3各类卵巢组织中的趋化因子配体18基因mRNA比较

2.4卵巢癌组织中趋化因子配体18基因mRNA表达与其临床病理的关系

2.5利用寿命表法进行生存分析

2.6卵巢癌组织中趋化因子配体18基因mRNA表达与其预后的关系

3讨论

第三章趋化因子配体18重组成熟肽段的表达

1材料与方法

1.1材料

1.2引物设计与合成

1.3实验方法

2结果

2.1 CCL18成熟蛋白表达序列的克隆

2.2重组质粒PET SUMO-CCL18的构建

2.3重组融合蛋白的表达

2.4 MALDI-TOF-MS验证重组融合蛋白表达

2.5重组CCL18成熟肽段的表达

3讨论

第四章趋化因子配体18基因在卵巢肿瘤细胞中的定位及定量研究

1 材料与方法

1.1临床病例资料

1.2主要试剂及配制

1.3方法

2结果

2.1 LCM捕获各类细胞的条件建立及捕获效果

2.2免疫磁珠联合MALDI-TOF检测各种细胞中CCL18的表达情况

2.3不同卵巢上皮细胞中CCL18蛋白的定位

2.4不同卵巢上皮细胞中CCL18蛋白的初步定量

3讨论

第五章CCL18过表达介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外实验研究

1材料与方法

1.1 材料

1.2方法

2结果

2.1卵巢上皮癌组织中CCL18 cDNA全长PCR扩增结果

2.2重组真核表达质粒酶切鉴定结果

2.3重组真核表达质粒PCR结果

2.4重组真核表达质粒测序结果

2.5重组真核表达质粒转染前后卵巢癌细胞SKOV3 CCL18表达测定结果

2.6 CCL18过表达对体外细胞生长曲线的影响

2.7 CCL18过表达对细胞周期的影响

2.8 CCL18过表达对细胞体外侵袭，迁移和粘附能力的影响

3 讨论

第六章 RNA干扰卵巢上皮癌细胞系CCL18表达的体外实验研究

1 材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 CCL18 SiRNA有效片断筛选结果

2.2 CCL18 RNA干扰载体双酶切和测序鉴定结果

2.3卵巢上皮癌细胞CCL18 RNA干扰前后其mRNA表达测定

2.4卵巢上皮癌细胞CCL18介导的生长曲线比较

2.5卵巢上皮癌细胞CCL18 RNA干扰前后生长周期比较

2.6卵巢上皮癌细胞CCL18 RNA干扰前后其外侵袭能力测定

2.7卵巢上皮癌细胞CCL18 RNA干扰前后其外迁移能力测定

2.8卵巢上皮癌细胞CCL18 RNA干扰前后其外粘附能力测定

3讨论

全文小节

参考文献

致谢