EZH2在肝细胞癌中的表达及miR-101对EZH2表达的调控研究

摘要

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，多种基因变异与HCC发生相关。EZH2(enhancer of zeste homolog 2)是果蝇zeste基因增强子的人类同源基因，为Polycomb group基因家族的重要成员之一。Ploycomb group(PcG)和Trithorax group(trxG)都是进化过程中保守的染色质修饰基因，通过PcG和trxG蛋白的相互拮抗作用，维持同源异型基因的沉默和活化状态，其中PcG维持同源异形基因的失活状态，trxG蛋白则维持基因的激活状态。近年来，EZH2在多种肿瘤中高表达，具有促进细胞增殖，肿瘤细胞扩散的作用。
　　 近几年来，一类小分子对基因表达的调控作用引起了广大生物研究者的关注，即microRNA(miRNA)。miRNA是一类长度在19～24个核苷酸左右的进化保守的内源性非编码小分子RNA，在动植物中成为一类基因调控子。依据与靶mRNA的互补程度不同通过两种方式负调节靶基因的表达。当miRNA与靶mRNA完全互补结合，作用方式和功能与RNAi(RNA-mediated interference)非常类似，由miRNA相关的多蛋白RNA介导的沉默复合物(themRNA-associated，multiprotein RNA induced-silencing complex,miRISC)切割靶mRNA，引起靶基因mRNA的降解，这一机制在植物当中比较普遍。然而，大部分动物miRNAs则是通过另一种不牵涉它们的靶mRNA断裂的机制来发挥作用。这些miRNAs与它们的靶mRNA3′-UTR区以不完全互补的方式结合，在转录后抑制靶基因的翻译，通过这种机制miRNAs降低了靶基因蛋白的表达水平，但该基因的mRNA水平几乎不受影响。
　　 近来的研究结果表明，miRNA突变和异常表达与各种人体肿瘤发生、发展相关，miRNA能抑制多种重要肿瘤相关基因的表达，可作为癌基因或抑癌基因而起作用。深入研究miRNA在人体肿瘤中的表达状况及其功能，对研究肿瘤的发生、发展和转移的机制具有重要意义，并将有利于肿瘤的诊断、治疗及预后判断。
　　 目的：检测EZH2和miR-101在HCC中的表达，探讨miR-101对EZH2表达的调控及其意义。
　　 方法：1.采用本课题组收集的广西医科大学一附院2005年12月-2006年9月期间经病理确诊的HCC患者42例，取其肝癌组织及其癌旁组织，9例血管瘤患者的瘤旁组织作为正常对照。采用RT-PCR方法检测EZH2mRNA在肝癌、癌旁及正常组织中的表达情况，分析EZH2mRNA与HCC临床病理特征的关系。
　　 2.采用免疫组织化学方法检测EZH2蛋白在肝癌、癌旁及正常组织中的表达情况，分析EZH2蛋白与HCC临床病理特征的关系。
　　 3.选用国内外最常用也是最权威的三个miRNA预测软件：miRanda，PicTar和Targetscan，预测与EZH2mRNA3′-UTR有互补结合位点的miRNA。
　　 4.用Trizol提取总RNA，采用EzomicsTMmiRNAq-PCR Detection Primer Set、Real Master Mix(SYBRGreen)，以U6snRNA作为内参，进行实时荧光相对定量RT-PCR，测定18对肝癌及癌旁组织中成熟miR-101的转录水平。
　　 5.应用Western-blot方法检测18对肝癌及癌旁组织中EZH2蛋白表达情况。
　　 结果：
　　 1.RT-PCR检测42例肝癌组织EZH2mRNA阳性率为61.9％(26/42)，相对应的癌旁组织阳性率为28.6％(12/42)；正常肝组织阳性率为22.2％(2/9)。三组比较有显著差异(P＜0.01)，其中EZH2mRNA在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0.05)和正常肝组织(P＜0.05)，癌旁组织与正常组织比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。EZH2mRNA在肝癌组织中的阳性表达率与HCC分化程度有关(P＜0.05)，在低分化组的表达高于高-中分化组，而与肿瘤大小、HBV感染、AFP水平、肝内外转移以及是否伴有肝硬化无明显相关(P＞0.05)。
　　 2.免疫组化检测EZH2蛋白在肝癌中的阳性率为59.5％(25/42)，明显高于癌旁21.4％(9/42)及正常肝组织22.2％(2/9)。三组比较有显著差异(P＜0.01)，其中，EZH2蛋白在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0.05)和正常组织(P＜0.05)，癌旁组织与正常组织比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。EZH2蛋白在肝癌组织中的阳性表达率与肿瘤大小、分化程度、HBV感染、AFP水平、肝内外转移以及是否伴有肝硬化无明显相关(P＞0.05)。
　　 3.三个软件TargetScan、miRanda和PicTar均预测到miR-101与EZH2mRNAY-UTR有2个互补结合位点，提示EZH2mRNA为miR-101的靶mRNA。
　　 4.在18对肝癌及癌旁组织中均检测到miR-101，癌组织miR-101转录水平明显低于癌旁组织(0.34±0.18vs1.00±0.00)，差异显著(P＜0.01)。
　　 5.在所检测的18对肝癌及癌旁组织均有EZH2蛋白表达，癌组织EZH2表达量明显高于癌旁组织(0.90±0.30vs0.36±0.21)，有显著性差异(P＜0.01)。
　　 结论：
　　 1.EZH2在肝癌组织中呈较高表达，尤其在低分化肝癌中表达更高，提示EZH2在肝癌的发生发展中起重要作用。
　　 2.生物信息学预测EZH2mRNA为miR-101的靶mRNA。
　　 3.miR-101在肝癌组织中的转录水平明显低于癌旁组织；而EZH2在肝癌组织中的蛋白表达量明显高于癌旁组织，两者呈负相关关系，验证了EZH2为miR-101的靶基因，受miR-101负调控。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要中英文缩略语表

声明

第一部分EZH2在肝细胞癌中的表达及其意义

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分miR-101对EZH2表达的调控研究

分题一与EZH2　mRNA3’-UTR有互补结合位点的miRNA的生物信息学预测

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

分题二miR-101对EZH2蛋白表达的调控

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文总结

综述　EZH2在肿瘤发生发展中的研究进展

致谢