RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究

摘要

第一部分 shRNA真核表达载体构建及其对大肠癌SW480细胞凋亡的影响
　　目的:构建含有小发夹RNA（shRNA）的针对hTERT基因的重组真核质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA，并探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)的表达对大肠癌SW480细胞凋亡的影响。
　　方法:设计合成3条针对hTERT基因的siRNA，将筛选出最有效的siRNA合成shRNA寡核苷酸片段插入到真核质粒pGPU6/GFP/Neo中，进行酶切和测序鉴定。将构建好的重组真核质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA，采用脂质体法转染人大肠癌SW480细胞。在荧光显微镜下观察细胞转染效率及细胞形态学变化。RT-PCR法检测不同转染时间SW480细胞中hTERTmRNA的表达水平。TRAP-PCR-ELISA法检测转染48小时后SW480细胞的端粒酶活性。免疫组化法检测SW480细胞中hTERT蛋白的表达。流式细胞仪检测转染后细胞周期分布。TUNEL法检测转染后细胞凋亡状况。激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体跨膜电位(MMP)的变化。透射电镜观察转染后细胞超微结构。
　　结果:将筛选出干扰效率较好的的siRNA序列合成shRNA片段后，将其成功插入质粒pGPU6/GFP/Neo中，构成重组真核质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA。SW480细胞以质粒与脂质体比例为1∶2.5、转染48h时的转染效率较高，其转染率达59％。RT-PCR结果显示，hTERT-shR NA组的hTERTmRNA表达水平在转染48h时降低较明显，与空白组、脂质体组、NC-shRNA组比较，抑制率分别是39.20％，33.28％，27.95％。TRAP-PCR-ELISA结果示，hTERT-shRNA组SW480细胞端粒酶活性显著降低18.7％，与其它三组比较，差别均有统计学意义(P＜0.05)。免疫组化结果示，hTERT-shRNA组被染色的阳性细胞明显少于其他组，经病理图像分析软件分析灰度值后得出，转染48h后hTERT-shRNA组与空白组比较，差异有明显统计学意义（P＜0.05），同时与脂质体组和NC-shRNA组比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)。流式细胞仪结果示，hTERT-shRNA组G0/G1期细胞显著增加，S期细胞减少，提示hTERT-shRNA质粒转染SW480细胞后，使进入静止状态的细胞增多，细胞增殖指数下降约14.2％，与NC-shRNA组比较，差别有显著统计学意义(P＜0.05)。TUNEL结果示，与其他组比较，hTERT-shRNA组凋亡细胞数显著增多，凋亡指数为21.5％，明显比其他组增高，差异有统计学意义(P＜0.01)。激光共聚焦显微镜观察结果，hTERT-shRNA组可见多个含有核分裂相的细胞，细胞Rh123荧光强度明显增强，MMP显著下降，与其他组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。透射电镜观察结果示，SW480细胞体积明显缩小，表面突起及微绒毛减少，甚至消失，细胞核固缩，染色质不均匀地沿核膜下聚集，空泡增多。
　　结论:成功构建了针对hTERT基因的重组真核表达质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA。它能有效沉默hTERT基因，因而能有效抑制人大肠癌SW480细胞增殖生长，降低端粒酶活性，最终促使肿瘤细胞凋亡。
　　第二部分 RNAi沉默hTERT基因对人大肠癌SW480细胞荷瘤裸鼠的治疗作用
　　目的:研究靶向hTERT基因的重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA对人大肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤的治疗作用。
　　方法:于裸鼠右侧腋下皮下注射人大肠癌SW480细胞建立大肠癌移植瘤动物模型，待肿瘤长到一定大小时，随机分为生理盐水组（NS组）、NC-shRNA组和hTERT-shRNA组。各组连续进行相应治疗6次后，观察肿瘤的生长状况，测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，HE染色观察肿瘤组织细胞形态学变化，免疫组化法检测移植瘤组织中hTERT蛋白的表达，TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡情况，RT-PCR法检测瘤组织中hTERTmRNA的表达，PCR-TRAP-ELISA法检测肿瘤组织的端粒酶活性。
　　结果:所有裸鼠在接种SW480细胞第14天后，皮下肿瘤结节直径达5～7mm，成功构建了裸鼠移植瘤模型，成瘤率为100％。荷瘤裸鼠开始治疗后，hTERT-shRNA组瘤体积增长速度慢于NS组和NC-ShRNA组，并于第18天开始明显减慢。HE染结果示，hTERT-shRNA组肿瘤组织出现局部坏死区，瘤组织细胞形态发生明显改变。免疫组化法检测结果示，hTERT-shRNA组肿瘤组织中hTERT蛋白表达水平下降，可见少量hTERT蛋白阳性细胞，细胞呈浅棕色。TUNEL法检测结果示，hTERT-shRNA组凋亡细胞数明显增多，细胞分布密集，与NS组和NC-shRNA组比较，凋亡指数分别增加29.4％和31.1％，差异有显著统计学意义（P＜0.01）;RT-PCR法检测结果示，hTERT-shRNA组hTERTmRNA表达水平较NS组和NC-shRNA组分别下降52.1％和48.3％，差异具有显著性意义(P＜0.01)。PCR-TRAP-ELISA法检测结果示，hTERT-shRNA组与NS组和NC-shRNA组比较，端粒酶活性降低较明显，抑制率分别为48.5％和53.0％，差异有统计字意义(P＜0.05)。
　　结论:重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA通过下调hTERTmRNA和hTERT蛋白的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，从而抑制大肠癌移植瘤的生长。

目录

声明

摘要

主要英文缩写索引

前言

第一部分 shRNA真核表达载体的构建及其对大肠癌SW480细胞凋亡的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 RNAi沉默hTERT基因对人大肠癌SW480细胞荷瘤裸鼠的治疗作用

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

端粒、端粒酶与肿瘤治疗的研究进展

攻读硕士研究生学位期间发表的论文

致谢