RNA干扰（RNAi）技术抑制大肠癌细胞人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的实验研究

摘要

目的：通过RNA干扰技术对大肠癌细胞人端粒酶逆转录酶hTERT基因的特异性抑制作用，为RNA干扰技术对大肠癌的基因治疗提供理论依据。 方法：1.大肠癌细胞株HT-29的培养传代。2.化学合成靶向于hTERT基因的siRNA，用脂质体转染法将其导入大肠癌细胞内。3.实验分组如下：Control组(未转染的HT-29细胞)，Lipofectamine组(脂质体组)，加入阴性对照N-hTERTsiRNA组(简称阴性组)，加入干扰hTERT的sihTERT组(RNA干扰组)。4.通过TRAP，RT-PCR和Western Blot方法分别检测大肠癌细胞转染前后细胞的端粒酶活性，hTERTmRNA和蛋白水平，流式细胞仪检测细胞生长增殖和凋亡情况。 结果：1.荧光显微镜照片fluorescence显示大肠癌HT-29细胞的转染效率为60％。 2.Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组的端粒酶活性分别为1.14±0.21，1.10+0.19，1.17±0.22，0.73±0.14，sihTERT组的端粒酶活性明显下降，与其他三组相比差异有非常显著性(P〈0.01)。 3.hTERT mRNA在Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组中的表达分别为0.87±0.15，0.91±0.16，0.85±0.14，0.47±0.08，sihTERT组与其他三组相比，hTERT mRNA表达水平显著下降，差异有非常显著性(P<0.01)。 4.hTERT蛋白在Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组中的表达分别为0.62±0.12，0.67±0.13，0.59±0.12，0.37±0.07，sihTERT组与其他三组相比，hTERT蛋白表达显著下降，差异有非常显著性(P<0.01)。 5.Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组的细胞凋亡率分别为(7.5±0.21)％、(8.6±0.24)％、(8.3±0.15)％和(49.5±0.26)％，sihTERT组细胞凋亡率明显升高，与其他三组相比差异有非常显著性(P<0.01)。 结论： RNA干扰技术能特异性沉默大肠癌细胞hTERT基因，下调hTERT基因mRNA及蛋白表达水平，降低端粒酶活性，抑制癌细胞生长增殖从而促进大肠癌细胞凋亡，为大肠癌的基因治疗研究提供理论依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第1章引言

第2章材料与方法

2.1材料

2.2实验方法和步骤

2.2.1大肠癌HT-29细胞培养

2.2.2细胞转染

2.2.3 TRAP法检测大肠癌HT-29细胞转染前后端粒酶活性

2.2.4 RT-PCR技术检测HTERTmRNA含量

2.2.5蛋白量变化检测

2.2.6细胞生长增殖和凋亡测定

2.2.7统计分析

第3章结果

3.1细胞转染结果

3.2 siRNA试剂对GAPDH的干扰

3.3TRAP法检测端粒酶活性结果

3.4 RT-PCR法检测hTERTmRNA的表达水平

3.5 Western blot检测hTERT蛋白表达水平

3.6 hTERTsiRNA对HT-29细胞生长抑制作用

第4章讨论

第5章结论与展望

致谢

参考文献

综述 人端粒酶逆转录酶在大肠癌治疗中的应用及其意义的研究进展

攻读学位期间的研究成果