5-HTT与肺动脉平滑肌细胞凋亡在左向右分流肺动脉高压大鼠中关系的研究

摘要

肺动脉高压(PAH)是指以肺动脉压、肺血管阻力进行性增高，终末期导致患者右心衰竭及死亡为特征的一种疾病。肺动脉高压通过复杂的病理机制，导致患者在肺组织结构、分子信号途径和基因表达等多个方面均发生了异常。目前研究发现，肺动脉高压是在炎症、异常血流剪切力、缺氧等因素的诱发下，细胞因子及血管活性物质异常产生，并作用于血管平滑肌细胞、血管内皮等靶细胞，导致肺血管异常收缩、生长和重构、细胞外基质堆积等一系列后果，最终形成肺动脉高压，其中肺血管重构是肺动脉高压主要的病理学特征。
　　研究表明，细胞的异常增殖，凋亡减少是组织构型重建的重要原因之一。凋亡是有核细胞在某些生理或病理情况下，基因特定程序被启动，通过DNA内切酶发生有序的主动性非炎症性死亡，又称细胞程序性死亡。细胞凋亡和增殖是矛盾的两个对立面，它们之间的平衡维持着机体组织结构的正常状态和生理功能。越来越多的研究证明，肺动脉平滑肌细胞增殖增加和/或凋亡减少都可促进肺血管中膜肥厚和血管构型重建，是肺动脉高压发病的一个重要机制。正常情况下，血管壁结构是相对稳定的，由相应细胞的增殖和凋亡共同协调维持，当血管壁在各种内因和外因（如细胞因子、缺氧、血流剪切力等）的刺激作用下，肺动脉平滑肌细胞经过一系列信号转导过程，启动内部增殖基因和/或凋亡抑制基因的表达，导致肺动脉平滑肌细胞的增殖增多和/或凋亡减少，促使肺动脉平滑肌细胞增殖、肥大、迁移，最终引起肺血管壁增厚和肺血管重构。目前，很多学者把抗肺血管重构的目光转移到促进肺动脉平滑肌细胞凋亡这个靶点上，促进肺动脉平滑肌细胞凋亡可能成为未来治疗肺动脉高压的突破口。
　　5-羟色胺转运体（5-HTT）是一种膜蛋白，表达于神经元、血小板、肺动脉平滑肌细胞等体细胞中，主要功能是将5-羟色胺(5-HT)转运至细胞内部发挥生物学效应。5-羟色胺可经细胞膜上的5-羟色胺转运体介导进入肺动脉平滑肌细胞，并通过多条促增殖信号转导途径引起肺动脉平滑肌细胞增殖肥大，导致肺血管构型重建。研究结果表明5-羟色胺转运体在许多类型的肺动脉高压发病机制中起重要作用，但在左向右分流型肺动脉高压中，是否也存在5-HTT的高表达，它与肺动脉平滑肌细胞凋亡状况有无关系，目前尚未见相关报导。
　　他汀类药物是一种3-羟基，3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，它所具有的降脂、稳定粥样斑块、改善内皮细胞功能、抑制血小板聚集、抗炎抗氧化、免疫调节等作用使其广泛应用于心脑血管疾病等领域。近来，越来越多的学者开始关注他汀类药物的“非调脂作用”，国内外有研究发现他汀类药物可通过与肺动脉高压发生的各个环节产生作用，降低肺动脉压力，缓解肺血管过度收缩，抑制肺血管重建，他汀类药物的这些作用可能与诱导肺动脉平滑肌细胞或血管内皮细胞凋亡有关，用于治疗和预防肺动脉高压有相当广阔的前景。瑞舒伐他汀(rosuvastatin)是一种新型羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，是他汀类药物家族的新成员，其在肺动脉高压中的作用及机制报导甚少，更未见其对高肺血流性肺动脉高压影响的研究。
　　在本研究中，我们用腹腔分流法建立左向右分流大鼠肺动脉高压模型，通过观察模型大鼠肺动脉平滑肌细胞5-HTT的表达情况及肺动脉平滑肌细胞凋亡情况，了解大鼠肺高血流肺动脉高压的发生是否与这些因素有关，初步探讨肺高血流肺动脉高压可能的发病机制。同时，我们通过瑞舒伐他汀来干预肺高血流肺动脉高压大鼠模型，以观察瑞舒伐他汀是否对肺高血流大鼠肺组织中5-HTT的表达及肺动脉平滑肌细胞的凋亡产生影响，初步探讨瑞舒伐他汀在肺高血流模型大鼠肺血管重构中的作用机制。
　　方法:
　　1.将40只SD大鼠随机分为4组:①分流11周组、②分流8周组、③分流4周组、④对照组，每组各10只。分流11周组、分流8周组和分流4周组采用腹主动脉，下腔静脉分流法建立左向右分流大鼠模型，而对照组开腹但不建立分流。
　　2.在相应时间内处死大鼠，处死前测量大鼠肺动脉平均压(mPAP)，处死后对大鼠右心室和左心室+室间隔进行称重，计算右心室肥厚指数(RVI)。
　　3.常规石蜡包埋大鼠肺组织，切片并HE染色，观察各组大鼠肺组织小动脉的形态变化，计算管壁厚度占外径的百分比(WT％)及管壁面积占血管总面积的百分比(WA％)以此作为反映大鼠肺组织血管重构程度的指标。
　　4.用免疫组化SP法（链霉卵白素-过氧化物酶法）检测大鼠肺组织中5-HTT的表达情况。
　　5.用原位末端标记法（TUNEL法）检测大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡情况并计算TUNEL阳性细胞百分比(AI值)。
　　6.用Western Blot法检测各组大鼠肺组织中5-HTT，bcl-2蛋白的水平。
　　7.用RT-PCR检测各组大鼠肺组织中5-HTTmRNA的表达情况。
　　8.在上述实验的基础上，另将30只SD大鼠随机分为3组（每组10只）:①分流组;②分流给药组:分流手术后第二天开始给予瑞舒伐他汀(10 mg/kg)灌胃，每日1次，连续11周;③对照组。观察瑞舒伐他汀对高肺血流肺动脉高压模型大鼠肺组织中5-HTT、bcl-2蛋白表达(Western Blot法)及肺动脉平滑肌细胞凋亡(TUNEL法)的影响。
　　9.所得数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析，所有数据以mean士SD表示，两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，p＜0.05时认为差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1.随着分流时间的延长，分流各组大鼠平均肺动脉压、右心室肥厚指数(RVI)逐步升高，第11周模型大鼠出现明显肺动脉压力升高和右心室肥厚的表现，与其他各组间上述指标的差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.随着分流时间的延长，分流各组大鼠肺组织血管壁明显增厚，出现肺动脉平滑肌细胞肥大、增生、管腔狭窄，模型大鼠出现了明显的肺血管构型重建。同时，各分流组肺小动脉管壁厚度占血管外径百分比(WT％)、肺小动脉管壁面积占血管总面积百分比(WA％)也逐步升高，各组之间WT％、WA％值的差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　3.免疫组化结果显示随着分流时间的延长，各组大鼠肺组织中5-HTT的表达呈逐步升高的趋势，各组之间的差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　4.原位末端标记法检测结果提示各组大鼠肺组织内均存在一定比例的凋亡肺动脉平滑肌细胞。随着分流时间的延长，大鼠肺动脉平滑肌凋亡细胞逐步减少，凋亡指数(AI)也逐步下降。统计学分析显示各组间均有显著性差异(P＜0.05)。
　　5.Western Blot法检测结果提示随着分流时间的延长，各组大鼠肺组织中5-HTT蛋白、bcl-2蛋白的水平呈逐步升高的趋势，分流11周组与其他各组间指标的差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　6.RT-PCR检测结果提示随着分流时间的延长，各组大鼠肺组织中5-HTTmRNA表达水平呈逐步升高的趋势，其中分流11周组最为明显，与其他各组之间的差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　7.随着分流时间的延长，各组大鼠肺组织中5-HTT水平逐步升高，而凋亡指数(AI)逐步下降，相关性分析提示5-HTT水平与AI值之间呈明显负相关关系(P＜0.05)。
　　8.瑞舒伐他汀干预组大鼠肺组织中5-HTT、bcl-2蛋白水平较分流组明显降低，而干预组大鼠肺动脉平滑肌TUNEL阳性细胞百分比较分流组明显升高，统计分析显示两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.腹腔分流法能使模型大鼠出现肺动脉压明显升高、右心室肥厚、肺血管构型重建等肺动脉高压的病理改变。
　　2.左向右分流大鼠肺高压模型中存在着分流时间依赖的5-HTT、bcl-2蛋白高表达，而肺动脉平滑肌凋亡细胞百分比却低于正常水平，5-HTT介导的5-HT信号通路可能通过上调bcl-2蛋白表达，抑制肺动脉平滑肌细胞凋亡参与肺血管重构。
　　3.瑞舒伐他汀能明显缓解肺高血流大鼠肺动脉压力升高及肺血管重构，瑞舒伐他汀抑制模型大鼠肺血管构型重建可能与抑制肺组织中5-HTT、bcl-2蛋白的表达水平，提高肺动脉平滑肌细胞的凋亡数量有关。

目录

声明

摘要

英文缩写索引

第一部分 腹腔分流法对大鼠肺血管重构影响的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

图片

第二部分 5-羟色胺转运体与左向右分流肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡关系的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

图片

第三部分 瑞舒伐他汀对高肺血流大鼠肺血管重构影响的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

图片

本研究的创新和自我评价

参考文献

文献综述 利用动物模型研究肺动脉高压

在学期间科研成绩

致谢