同种异基因成骨细胞组织工程骨移植修复兔桡骨骨缺损免疫反应的初步研究

摘要

目的:
　　探讨由骨髓间充干细胞诱导而成的成骨细胞，体外对同种异基因T淋巴细胞免疫调节及由该种成骨细胞与羟基磷灰石-磷酸三钙构建的工程化骨，移植修复同种异基因兔桡骨骨缺损免疫反应来探讨同种异基因组织工程骨的免疫性，为同种异基因成骨细胞构建工程骨移植修复骨缺损提供实验依据。
　　方法:
　　1、骨髓间充质干细胞的获取与鉴定
　　取中国家兔骨髓，密度梯度离心法并结合贴壁传代分离、获取、纯化骨髓间充质干细胞，观察细胞形态和检测表面标志物的表达，MTT法测定第3代细胞的增殖情况，并绘制出生长曲线，并进行成脂肪诱导油红O染色鉴定。
　　2、骨髓间充质干细胞成骨诱导的研究
　　取生长良好的传三代细胞，用成骨诱导培养基进行诱导，观察细胞形态，并分别于培养的第2天、第5天、第8天、第11天、第14天收集细胞，进行细胞内碱性磷酸酶含量测定;于诱导7天时行Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色，于诱导14天行骨钙素免疫细胞化学染色，于诱导21天时行钙化结节染色同时用扫描电镜观察细胞形态和基质分泌。
　　3、成骨细胞对混合淋巴细胞培养体系中同种异基因T细胞亚群的免疫调节
　　取新西兰白兔外周静脉血，密度梯度离心法和尼龙毛柱法分离、获取、纯化，培养T淋巴细胞，并检测其浓度。以中国家兔成骨细胞为刺激细胞，新西兰兔T细胞为反应细胞建立混合淋巴细胞培养体系，MTT法测定T细胞增殖、流式细胞仪检测T细胞凋亡。
　　4、同种异基因组织工程骨的构建
　　取中国家兔成骨细胞接种在HA-TCP支架材料上，接种后第4、8、12、24小时取样测定细胞的粘附率;荧光显微镜观察成骨细胞在HA-TCP表面生长情况;复合培养3周后，取材行扫描电镜观察细胞在材料表面的生长增殖和基质分泌情况，RT-PCR检测Ⅰ型胶原表达。
　　5、异基因组织工程骨移植修复骨缺损免疫初步研究
　　(1)分别将组织工程骨(TEB、Ⅰ组)，单纯HA-TCP(Ⅱ组)，自体骨(Ⅲ组)分别随机植入兔桡骨骨缺损处，常规喂养，观察各组动物全身及骨缺损伤口局部情况。
　　(2)术后6周，行X线片检查，观察桡骨骨缺损处骨愈合情况，各组植入物与宿主骨缺损处骨质愈合大体情况以及超微结构变化情况。
　　(3)术后4天，10天，6周分别测定脾重指数，EDU细胞染色观察脾内细胞增殖情况;HE染色观察脾大体病理变化，透射电镜观察淋巴细胞超微结构变化;ELISA检测脾脏内细胞IFN-γ，IL-10表达水平;RT-PCR检测脾内细胞IFN-γmRNA、IL-10mRNA的表达情况。
　　结果:
　　1、经密度梯度离心结合贴壁法分离、纯化所获得到的细胞形态均一，呈长梭形，接近融合状态时可呈现旋涡样生长，细胞增殖检测曲线显示细胞自我增殖、更新能力强;所分离的细胞表达CD44、CD105，仅约2％表达CD34，成脂肪诱导油红染色阳性。
　　2、骨髓间充质干细胞成骨诱导后，细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形，多角形，最后成集落层叠生长;在诱导过程中，ALP含量逐渐增高，与对照组比较有显著性差异(p＜0.01);于诱导7天时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色，诱导14天骨钙素免疫细胞化学染色，诱导21天时钙化结节染色阳性;扫描电镜显示细胞生长旺盛，并分泌基质。
　　3、细胞接种4h，8h，12h，24h，36h细胞粘附率分别为44±1.5％，68±1.3％，78±1.0％，84±2.0％，87±1.8％。36h后，每块HA-TCP材料上细胞粘附率均达85％以上，培养3周后，荧光显微镜和扫描电镜均显示，成骨细胞在HA-TCP材料表面生长旺盛，形态良好，并长入支架材料孔隙中，并有基质分泌。
　　4、各组动物术后伤口愈合良好，局部炎症反应轻，无渗出。6周后，X线显示Ⅰ组中TEB与宿主骨结合处基本愈合，而Ⅱ组中HA-TCP与宿主骨愈合不满意，Ⅲ组中骨缺损处骨质愈合。三组骨缺损骨质愈合情况:Ⅲ组＞Ⅰ组＞Ⅱ组。透射电镜显示三组骨缺损处成骨细胞突入胶原纤维间，成纤纤维，胶原纤维丰富;三组比较:Ⅰ组成纤纤维，胶原纤维丰富;而Ⅱ组成纤纤维，胶原纤维相对较少;Ⅲ组成纤纤维，胶原纤维最丰富。
　　5、术后4天，10天，6周各时间点各组动物脾指数脾重量指数同组前后比较，前期稍高，后期稍低，但三组间比较，p＞0.05;HE染色可见各时间点脾形态结构正常，脾小结大小均匀，红髓、白髓无明显差异;只是早期红髓血管稍扩张、充血，但白髓无明显扩大，脾小结淋巴细胞稍多;形态无明显改变。后期红髓形态恢复正常，脾小结淋巴细胞较早期减少。脾内细胞增殖同组前后比较，前期稍高，后期稍低，但三组间比较，p＞0.05;电镜显示，Ⅲ组淋巴细胞结构基本正常，Ⅰ组与Ⅱ组淋巴细胞线粒体均不同程度的出现线粒体空泡化、嵴断裂、紊乱、肿胀、凝集;内质网扩张、间隙增宽脱颗粒;染色质浓缩、边集，染色体疏松等，高尔基复合体和各级溶酶体明显增多，粗面内质网明显脱颗粒，Ⅰ组较Ⅱ组明显。术后4天，10天，6周脾内细胞IFN-γ、IL-10水平及IFN-γmRNA、IL-10mRN表达，同组前后比较，前期稍高，后期稍低，P＞0.05;三组相比较P＞0.05，无统计学差异，各时间点相比较p＞0.05，无统计学差异。
　　结论:
　　1、采用密度梯度离心法结合细胞贴壁法分离BMSCs方法操作简单、易行，分离出的BMSCs纯度高，保持旺盛的增殖能力;在体外可诱导分化成成骨细胞，扩增迅速，性状稳定，符合组织工程种子细胞的基本条件。
　　2、由BMSCs体外诱导成的成骨细胞有一定免疫原性，但极低，可以抑制异基因T细胞增殖，推测其可能促使CD8+细胞凋亡有关。
　　3、由同种异基因BMSCs诱导成的成骨细胞与HA-TCP材料体外构建组织工程骨，简单易行，确切，基本符合组织工程骨的要求。
　　4、同种异基因成骨细胞与HA-TCP构建的组织工程骨，免疫性极低，成骨能力强，可以用于修复骨缺损。

目录

声明

英文缩略词

摘要

前言

第一部分 同种异基因成骨细胞对混合淋巴细胞培养体系中T细胞亚群的免疫调节

1．1 材料与方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 结论

第二部分 构建同种异基因成骨细胞组织工程骨的研究

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 结论

第三部分 异基因成骨细胞构建组织工程骨修复兔桡骨干骨缺损早期免疫反应的实验研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 结论

参考文献

全文小结与展望

综述 骨组织工程免疫性研究进展

致谢

攻读博士学位期间(待)发表的论文