鸟分枝杆菌耐受活性氮和活性氧基因的筛选及功能研究

摘要

目的:鸟分枝杆菌是细胞内寄生菌，在艾滋病晚期常可发生鸟分枝杆菌的扩散性感染。巨噬细胞作为分枝杆菌的宿主细胞，其内微环境包含有多种杀（抑）菌机制，比如酸、活性氧(ROS，如O2、H2O2)和活性氮(RNS，如NO、NO2)、多种溶菌酶、抗菌肽等。这些机制的存在，理论上可以有效的抑制进入巨噬细胞的病原细菌。但是，某些病原细菌在感染早期显然能够耐受这些杀（抑）菌机制，在巨噬细胞内大量繁殖，为后续全身性的胞外感染奠定基础。本文通过构建鸟分枝杆菌基因组文库，筛选耐受活性氮和活性氧相关基因，以探讨鸟分枝杆菌适应巨噬细胞的杀（抑）菌机制，为深入研究鸟分枝杆菌的致病机理给出新的线索，进而为新药物的开发提供可能的靶点。
　　方法:(1)利用CTAB法提取鸟分枝杆菌基因组DNA，用Sau3AⅠ部分酶切后与用BamHⅠ酶切并经磷酸化处理的pUC19质粒连接，转化大肠杆菌JM109，构建鸟分枝杆菌基因组文库;(2)利用生物活性水平筛选方法，通过含有NaNO2的培养液，从鸟分枝杆菌基因组文库中筛选耐受活性氮的克隆子;(3)对所得的克隆子进行测序以获取插入片段的序列，通过生物信息学分析获取插入序列的信息和目的基因;(4)根据目的基因的开放阅读框架设计引物，利用PCR扩增目的基因，与相应的表达载体连接后构建重组表达质粒;(5)重组表达质粒在大肠杆菌诱导表达及表达产物的SDS-PAGE检测;(6)分别以NaNO2、GSNO、H2O2、SDS作为胁迫，通过计算平板菌落数(CFU)或测定吸光度值，分析重组目的基因的耐受性。(7)利用生物信息学对目的基因编码蛋白的理化性质、空间结构和功能位点进行预测分析。
　　结果:构建的鸟分枝杆菌基因组文库滴度为8×103cfu/ml，随机挑选10个克隆进行BamHⅠ酶切分析，可见插入片段大小约在100-750bp之间，基本达到文库建立的要求。通过含有NaNO2的培养液，从构建的鸟分枝杆菌基因组文库中筛选到一个耐受活性氮的克隆子，测序结果分析表明，该克隆子的插入序列有两个读码框，一个编码目的基因（取名为noA），另一个编码P49蛋白基因，分别处在插入序列的两条链上。构建noA重组表达质粒做NaNO2、GSNO、H2O2、SDS胁迫试验，结果显示noA耐受NaNO2、GSNO、H2O2的能力明显高于对照，而其耐受SDS的能力与对照没有显著性差异。
　　结论:从鸟分枝杆菌基因组文库中筛选到一个能抵抗NaNO2、GSNO、H2O2胁迫的基因-noA，这是一个新型的耐受活性氧和活性氮基因。从预测的理化性质、功能位点及结构特点推断，noA蛋白有可能成为诊断、治疗或者预防鸟分枝杆菌病的有价值的靶分子。

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英文缩略语表

摘要

前言

第一章 鸟分枝杆菌基因组文库的构建

1 材料与仪器

1．1 实验材料

1．2 主要仪器设备

1．3 主要试剂配置

2 实验方法

2．1 JM109感受态细胞的制备(CaCl2法)

2．2 感受态细胞转化率检测

2．3 乌分枝杆菌基因组DNA制备(CTAB抽提法)

2．4 pUC19质粒去磷酸化处理

2．5 基因组DNA部分酶切

2．6 连接与转化

2．7 文库鉴定

3 实验结果

3．1 E.coli JM109感受态细胞转化率检测

3．2 基因组DNA提取结果

3．3pUC19质粒去磷酸化处理和基因组部分酶切

3．4 文库构建及质量检测

4 分析与讨论

第二章 耐受活性氮基因的筛选

1 材料与仪器

1．1 实验材料

1．2 主要仪器设备

1．3 主要试剂配制

2 实验方法

2．1 文库的筛选

2．2 测序及序列初步分析

3 实验结果

3．1 基因组文库的筛选及目的克隆的获得

3．2 序列分析结果

4 分析与讨论

第三章 MAC-noA耐受活性氮和活性氧的功能研究

1 材料与仪器

1．1 实验材料

1．2 主要仪器设备

1．3 主要试剂配制

2 实验方法

2．1 MAC-noA引物设计及扩增

2．2 pUC19-noA重组载体构建

2．3 pGEX-noA和pET-noA重组表达载体的构建

2．4 原核表达及检测

2．5 MAC-noA耐受活性氮和活性氧的功能研究

3 实验结果

3．1 PCR扩增和重组载体构建

3．2 耐受活性氮和活性氧的功能研究结果

4 分析与讨论

第四章 MAC-noA编码蛋白生物信息学分析

1 分析方法

2 结果与分析讨论

2．1 理化性质分析

2．2 二级结构分析

2．3 功能位点分析

2．4 同源性分析与进化树的建立

2．5 同源建模

总结

参考文献

综述 结核分枝杆菌耐受活性氧和活性氮基因的研究进展

论文说明

致谢

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