液相色谱-多反应监测质谱技术中一种新的标准曲线计算方法及其在人肝微粒体药物代谢酶中的应用

摘要

在研究细胞、组织或体液中的蛋白质组时，不仅需要对这些蛋白质组进行定性分析，更需要对其进行定量分析。生物体中蛋白质的绝对量以及量的变化对于揭示生物体的生理状态及病理状态具有重要意义，因此，目标蛋白质学已经成为蛋白质组学的一个研究热点。人肝微粒体中的CYP和UGT酶是药物进行代谢的主要酶类，其表达水平受到基因多态性的影响，存在着个体差异性。由于这些药物代谢酶量的不同对药物的生物利用度具有很大的影响，因此，对药物代谢酶含量进行准确定量不仅在要去研发，而且在临床应用中具有重要意义。高效液相色谱-同位素稀释法-多反应监测质谱（HPLC-SID-MRM MS）方法因其高灵敏度、高选择性、高准确性和高通量的特点，加之不需要特异性抗体，已经成为药物代谢酶定量分析的常用方法，可同时对复杂生物样本中多个蛋白进行定量。但是，这种定量方法应用于复杂生物样本中多个蛋白定量时，存在空白样本基体难以制备的问题，文献中多采用基体缓冲液或外源性基体代替，这会使定量的准确性变差，因此，实际样本作为基体的同位素稀释法可有效解决空白基体的制备问题，但其中内源分析物含量的计算一般采用单浓度点计算或不同浓度点计算后取平均值的方法，影响内源分析物含量的准确度，为此，我们提出一种建立标准曲线的线性回归方法计算内源性分析物，即内源性目标肽段的计算方法，提高了定量方法的准确性。将建立的定量方法应用于20例人肝微粒体中的21种药物代谢酶进行了含量测定，揭示了正常中国人药物代谢酶的含量范围及不同酶之间的相关性关系，对药物研发和临床用药具有一定的指导意义。另外，高效液相色谱分离可降低复杂生物样本的复杂度，有利于提高蛋白定量的准确度，为此，制备了一种亚2μm反相色谱填料，并对其进行了性能评价。
　　本论文共分为四个部分。第一章概述了定量蛋白质学的研究意义及现状以及高效液相色谱-多反应监测质谱（SID-MRM MS）方法、内标肽段制备技术、人肝微粒体中药物代谢酶定量方法以及亚2μm反相色谱填料制备技术的研究进展，在此基础上提出了本论文的研究内容和目标。
　　在第二章中，提出了在应用同位素稀释结合多反应监测质谱(SID-MRMMS)技术进行复杂生物样本中蛋白质定量中一种新的标准曲线计算方法，并应用于人肝微粒体药物代谢酶的含量测定。实验结果表明与单浓度点计算方法比较，可提高定量的准确度，即所建方法的回收率为97.0％、定量限LOQ为低于20 fmol、5次测量的变异系数低于10％、线性范围为低于20fmol-1000 fmol。进一步将此种方法应用于5例人肝微粒体样本中的21种药物代谢酶含量的测定，测定结果与文献报道结果一致。
　　在第三章中，为了揭示正常中国人CYPs和UGTs的含量范围及个体差异性，将建立的SID-MRM MS方法对20例正常中国人人肝微粒体中的21种药物代谢酶进行了准确定量，并且统计分析了不同药物代谢酶之间的含量相关性关系。其中个体差异性最大的药物代谢酶是CYP3A4、CYP3A5和 UGT1A1;其中CYP3A4的个体差异性达129倍，CYP3A5的个体差异性达99倍，UGT1A1的个体差异性达到170倍;其次CYP1A2、CYP2A6和UGT2B10的个体差异性达到几十倍左右。药物代谢酶表达水平的两两相关性通过非参数施佩尔曼秩检验(Spearman rank test)进行相关性分析(p=0.01)，分析结果显示:CYP1A2、CYP2C8和CYP2C9酶表达水平具有两两正相关性，UGT1A6、UGT1A9、UGT2B4和UGT2B7酶的表达水平具有两两正相关性。
　　在第四章中，采用“点击化学”的合成方法制备了亚2μm反相色谱填料，FT-IR红外光谱和元素分析表征结果为:在红外光谱中，2924.97cm-1和2824.70cm-1为C18链亚甲基特征吸收峰;元素分析数据表明C的含量从0增加到42.73％。这些结果表明C18成功键合到硅球表面。将合成后的填料装成10cm的毛细管柱进行色谱性能评价，BSA酶切混合物的色谱图显示在紫外检测器条件下可检测到30个色谱峰，与同类商品化反相色谱填料性能相当。

目录

声明

简历

摘要

第一章 前言

1 液相色谱多反应监测质谱方法

1．1 稳定同位素稀释法

1．2 稳定同位素标记技术

1．3 多反应监测质谱技术

2 内标肽段制备技术

3 人肝微粒体中药物代谢酶定量方法

4 亚2μm反相色谱填料制备

4．1 超高液相色谱技术

4．2 亚2μm颗粒色谱填料

4．3 新型色谱填料

5 本文研究内容及意义

第二章 用于同位素稀释质谱法的一种新的标准曲线计算方法及其在药物代谢酶绝对定量中的应用

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

1．2 实验方法

2 结果和讨论

2．1 QconCAT重组蛋白酶切

2．2 QconCAT重组蛋白57条酶切肽段标记效率的考察

2．3 样本中内源分析物浓度的计算及验证

2．4 对所建方法性能评价

2．5 人肝微粒体中药物代谢酶含量测定

3 结论

第三章 高效液相色谱结合多反应监测质谱技术用于20例正常中国人药物代谢酶定量测定

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

1．2 样品信息

1．3 实验方法

2 结果与讨论

2．1 液相多反应监测质谱的质谱分析

2．2 数据处理标准

2．3 20例人肝微粒体样本中的21种药物代谢酶含量测定

2．4 20例人肝微粒体样本21种药物代谢酶的个体差异性以及含量分布情况

2．5 酶表达水平的相关性分析

3 结论

第四章 基于点击化学的亚2μm反相色谱填料的制备及其性能评价

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

1．2 内嵌PEG极性基团的C18反相亚2μm色谱填料的制备

1．3 色谱柱的填装

2 结果和讨论

2．1 硅球氨基化修饰红外表征结果

2．2 氨基化硅球与NHS-PEG4-Azide反应后红外表征结果

2．3 C18修饰硅球的FT-IR傅里叶红外光谱分析和能谱分析

2．4 合成后硅球TEM透射电镜分析

2．5 点击化学反应固定相的色谱评价

3 结论

全文小结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间取得的科研成果