基于EGFR、STAT3信号通路探讨苇茎汤及其拆方诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的作用机制

摘要

目的：通过体外实验研究苇茎汤及其拆方对人肺腺癌A549细胞活性、凋亡及其相关信号通路EGFR、STAT3的影响，为苇茎汤的临床应用提供理论依据。
　　方法：采用MTT法检测不同剂量(低剂量、中剂量、高剂量)苇茎汤全方及其拆方清肺化痰方(苇茎)、渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)和活血化瘀方(桃仁)对人肺腺癌A549细胞生长的抑制作用；以倒置显微镜观察苇茎汤及其拆方对肺癌细胞的形态学影响；以荧光显微镜结合AO∕EB和DAPI荧光染色观察苇茎汤及其拆方对肺癌细胞凋亡的形态学影响；利用流式细胞术检测细胞周期，测定细胞凋亡率；应用Western blot和实时荧光定量RT-PCR技术分别从蛋白和基因两个层面检测苇茎汤及其拆方对A549细胞中凋亡信号通路EGFR、STAT3的影响。
　　结果：
　　1.MTT法检测结果显示，与阴性对照组相比，不同剂量苇茎汤及其拆方作用24h、48h、72h后，A549细胞OD值均出现不同程度的下降，且细胞抑制率具有时间-剂量依赖性；相同剂量(中剂量)苇茎汤及其拆方作用A549细胞24h、48h、72h后，各拆方对细胞的抑制作用以清肺化痰方(苇茎)最为明显，其次是活血化瘀方(桃仁)，渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱，苇茎汤全方优于各拆方。
　　2.倒置显微镜观察发现，中剂量(2.5g·L-1)苇茎汤及其拆方作用48h后，均能使A549细胞发生不同程度的形态学改变，各拆方对细胞的作用以清肺化痰方(苇茎)最为明显，其次是活血化瘀方(桃仁)，渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱，苇茎汤全方优于各拆方。
　　3.AO∕EB荧光染色结果显示，与阴性对照组相比，中剂量(2.5g·L-1)苇茎汤及其拆方作用48h后，A549细胞的数量减少，亮度增强，甚至出现大量橘红色、固缩状的凋亡细胞；对A549细胞凋亡形态的影响以清肺化痰方(苇茎)最为明显，其次是活血化瘀方(桃仁)，渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱，苇茎汤全方优于各拆。
　　4.DAPI荧光染色观察发现，与阴性对照组相比，中剂量(2.5g·L-1)苇茎汤及其拆方作用48h后，A549细胞的亮度增强，细胞核形态发生改变，染色质出现聚集、边缘化；对A549细胞凋亡形态的影响以清肺化痰方(苇茎)最为明显，其次是活血化瘀方(桃仁)，渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱，苇茎汤全方优于各拆方。
　　5.流式细胞术检测细胞周期结果显示，与阴性对照组相比，中剂量(2.5g·L-1)苇茎汤及其拆方作用48h后，G0∕G1期A549细胞数量显著增加(P＜0.01)，S期和G2∕M期的细胞数量减少。
　　6.流式细胞术测定细胞凋亡结果显示，与阴性对照组相比，中剂量(2.5g·L-1)苇茎汤及其拆方作用48h后，除渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)外，其余各组A549细胞的早期凋亡率均高于阴性对照组(P＜0.05)。
　　7.Western Blot结果显示，中剂量(2.5g·L-1)苇茎汤及其拆方作用48h后，A549细胞中凋亡相关蛋白EGFR、STAT3的表达水平均出现不同程度的下降，其中以清肺化痰方(苇茎)最为明显，其次是活血化瘀方(桃仁)，渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱，苇茎汤全方优于各拆方。
　　8.实时荧光定量RT-PCR结果显示，中剂量(2.5g·L-1)苇茎汤及其拆方作用48h后，A549细胞中凋亡相关基因EGFR，STAT3的表达出现不同程度的下调，其中以清肺化痰方(苇茎)最为明显，其次是活血化瘀方(桃仁)，渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱，苇茎汤全方优于各拆方。
　　结论:
　　1.苇茎汤及其拆方均能抑制A549细胞的生长，使其发生不同程度的形态学改变，其抑制率具有时间-剂量依赖性；各拆方对A549细胞的抑制作用以清肺化痰方(苇茎)最为明显，其次是活血化瘀方(桃仁)，渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱，苇茎汤全方优于各拆方。
　　2.苇茎汤及其拆方可能通过影响EGFR，STAT3信号通路诱导A549细胞凋亡，使其发生不同程度的凋亡形态学改变，并将其阻滞于G0∕G1期；细胞凋亡、细胞周期、EGFR和STAT3信号通路均是苇茎汤及其拆方抑制肺癌细胞生长的重要靶点。
　　3.苇茎汤方中诸药，以苇茎的抗肺癌作用最强；苇茎汤可能以清肺化痰为主，兼有渗湿化痰、活血化瘀之功效，“三化”(清肺化痰、渗湿化痰、活血化瘀)并举，可使抗癌疗效增强。

目录

封面

声明

目录

符号与缩略语

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学分析[38-39]

实验结果

1 苇茎汤及其拆方对人肺腺癌A549细胞生长活性的影响

2 苇茎汤及其拆方对人肺腺癌A549细胞显微结构的影响

3 苇茎汤及其拆方对人肺腺癌A549细胞凋亡形态的影响

4 苇茎汤及其拆方对人肺腺癌A549细胞周期的影响

5 苇茎汤及其拆方对人肺腺癌A549细胞凋亡率的影响

6 苇茎汤及其拆方对人肺腺癌A549细胞凋亡蛋白表达的影响

7 苇茎汤及其拆方对人肺腺癌A549细胞凋亡基因表达的影响

讨论

1祖国医学对肺癌的认识

2 苇茎汤及其拆方

3 苇茎汤及其拆方与人肺腺癌A549细胞活性

4 苇茎汤及其拆方与人肺腺癌A549细胞周期

5 苇茎汤及其拆方与人肺腺癌A549细胞凋亡

6 工作展望

结论

致谢

参考文献

附录1：附图

附录2 综述: 中药复方和复方制剂治疗肺癌机理的实验研究进展

附录3：在校期间论文论著和科研情况