南药青天葵多糖化学成分及抗补体免疫活性研究

摘要

目的:青天葵为兰科植物毛唇芋兰Nervilia fordii(Hance)Schltr.的干燥全草或块茎，具有显著的清热解毒作用，实验研究证明青天葵总多糖具有抗补体免疫活性。青天葵多糖的成分复杂，其分子量、糖链长度、单糖的组成和连接方式均会影响其药理作用。因此，本论文对青天葵多糖的提取、分离纯化、理化性质组成和结构进行系统研究，并对所获得的青天葵均一多糖进行抗补体免疫活性研究，为进一步阐明青天葵发挥“清热解毒”功效的物质基础提供理论依据。
　　方法:
　　1.采用水提醇沉法提取青天葵多糖粗品，Sevage法结合木瓜蛋白酶除去游离蛋白质后用DEAE-纤维素柱层析和Sephdex G-100凝胶柱层析进行分离纯化;采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)法进行分子量测定和纯度鉴定;采用PMP柱前衍生高效液相色谱法进行单糖组成分析;苯酚-硫酸测定总糖含量;Folin-酚法测定蛋白质含量;硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量;采用紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、一维核磁共振波谱(1D-NMR)、二维核磁共振波谱(2D-NMR)、甲基化-气质联用等方法进行结构分析。
　　2.采用体外细胞溶血免疫分子模型，以肝素钠注射液为阳性对照，测定均一多糖在补体经典激活途径和旁路激活途径中的抗补体活性，确定青天葵多糖的抗补体免疫活性。
　　3.采用MTT法测定均一多糖DT2-1和DT2-2对RAW264.7小鼠巨噬细胞增殖活性的影响，采用脂多糖(LPS)诱导RAW264.7小鼠巨噬细胞产生一氧化氮(NO)，构建体外细胞抗炎模型，并用青天葵多糖DT2-1和DT2-2进行干预。
　　结果:
　　1.从青天葵总多糖中分离得到5种均一多糖，分别为DT2-1、DT2-2、DT4-2、DT4-2及DT6-1，其分子量分别为1280、950、1070、810、930KDa，总糖含量分别为78.64％、82.45％、86.13％、83.51、84.72％，蛋白质含量分别为3.95％、6.38％、5.63％、4.65％、5.44％，糖醛酸含量分别为8.44％、16.65％、4.01％、2.42、7.17％，其中DT2-1中主要含有半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)，三者的比例为3.4∶1.4∶1，含有少量的葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA);DT2-2中主要含有Gal（半乳糖）、Ara（阿拉伯糖）、鼠李糖(Rha)，三者的比例为2.1∶2∶1，含有少量的甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA);DT4-1中主要由葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)及阿拉伯糖(Ara)组成，三者的比例为2∶1.6∶1，含有少量的鼠李糖(Rha)、甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GlcA);DT4-2与DT6-1均主要由葡萄糖(Glc)及半乳糖(Gal)组成，比例分别为6.4∶1和3∶1，含有少量的鼠李糖(Rha)、甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GlcA)。
　　2.青天葵均一多糖DT2-1和DT2-2在补体经典激活途径和旁路途经中均无显著地抗补体活性;DT4-1、DT4-2及DT6-1具有显著地抗补体免疫活性，经典途径的CH50分别为54.21±2.62、77.54±2.12及51.46±2.38μg/ml，旁路途径的AP50分别为76.68±5.14、92.58±6.42及91.35±6.42μg/ml，它们的活性稍弱于阳性对照药肝素钠。
　　3.五个均一多糖均无细胞毒性，且可以显著提高RAW264.7小鼠巨噬细胞的增殖率;DT2-2、DT4-1、DT4-2和DT6-2在浓度10～300μg/ml时均可以显著抑制脂多糖(LPS)诱导RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌一氧化氮(NO)，而DT2-1则无明显抑制作用。
　　结论:从活性青天葵总多糖部位追踪得到5个均一多糖。通过体外溶血抗补体模型和LPS诱导RAW264.7小鼠巨噬细胞释放NO炎症模型，进一步证实青天葵多糖具有抗补体免疫活性，提示多糖类成分可能是青天葵发挥清热解毒功效的活性成分。

目录

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缩略语说明

摘要

前言

第一章 青天葵总多糖化学成分研究

第一节 青天葵总多糖分离纯化

1．1 材料与仪器

1．2 青天葵多糖提取与纯化

第二节 青天葵多糖一级结构和理化常数测定

2．1 实验仪器与材料

2．2 实验方法与结果

第三节 小结与讨论

第二章 青天葵均一多糖抗补体活性筛选

第一节 实验仪器和材料

1实验材料、试剂和仪器

第二节 青天葵均一多糖抗补体活性研究

2．1 补体经典途径的溶血活性(CH50)测定

2．2 多糖旁路途径的溶血活性(AP50)测定

第三节 小结与讨论

第三章 青天葵多糖抑制NO释放活性的研究

1 药品及仪器

2 RAW264．7 小鼠巨噬细胞的培养

3 MTT法观察细胞增殖活性的影响

3．2 细胞增殖活性测试结果

4 NO释放测定实验

4．1 Griess法原理

4．2 Griess法测定上清液NO2-

4．3 统计学处理

4．4 青天葵多糖对小鼠巨噬细胞分泌NO的影响

5 小结与讨论

全文总结与讨论

参考文献

第四章 综述：植物多糖的免疫调节作用

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文