益肾化瘀方拮抗肾间质纤维化有效部位筛选及对UUO大鼠肾组织TGF-β1、BMP-7的调控作用

摘要

目的：益肾化瘀方（YiShenHuaYuRecipe，YSHYR）是导师张琳琪教授经过多年临床实践经验总结出来的治疗慢性肾脏病的经验方；前期进行的慢性肾脏病2、3期肾虚血瘀证临床观察证实益肾化瘀方临床疗效显著，前期动物实验已初步证实其可通过调控相关细胞因子表达而具有拮抗RIF的作用。本实验以拮抗肾间质纤维化为指标，通过建立肾间质纤维化大鼠（UUO）模型，观察益肾化瘀方不同极性部位对UUO大鼠肾功能、肾组织病理形态和羟脯氨酸含量的影响，以及对肾间质纤维化标志蛋白 FN、TGF-β1、BMP-7表达的调控作用，从而初步筛选出益肾化瘀方拮抗肾间质纤维化的有效部位，为进一步探究其拮抗肾间质纤维化有效组分奠定理论基础。
　　方法：1.益肾化瘀方不同极性部位的提取：按照系统溶剂提取法，将益肾化瘀方按极性从小到大萃取出石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水饱和4个极性部位。
　　2.采用单侧输尿管结扎法建立大鼠肾间质纤维化（UUO）模型
　　将147只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、益肾化瘀方石油醚部位组、益肾化瘀方乙酸乙酯部位组、益肾化瘀方正丁醇部位组、缬沙坦组，每组21只。除假手术组外其余各组均采用单侧输尿管结扎法建立肾间质纤维化大鼠（UUO）模型；分别于UUO术后第3、7、14d，每组随机选取7只，腹主动脉采血检测肾功能；光镜下观察UUO大鼠肾组织病理形态学变化，采用碱性水解法检测肾组织中羟脯氨酸的含量，ELISA法检测肾组织中FN的表达变化，免疫组化检测肾组织TGF-β1、BMP-7的表达变化。
　　结果：（1）益肾化瘀方不同极性部位对UUO模型大鼠肾功能的影响与假手术组相比，模型组大鼠血清 BUN、Scr、CysC随着时间延长逐渐升高；与模型组相比，各给药干预组大鼠血清 BUN、Scr、CysC各时间点水平明显降低。
　　（2）益肾化瘀方不同极性部位对UUO模型大鼠肾组织病理形态的影响假手术组大鼠在不同时间点内肾组织病理均未见明显异常；模型组大鼠肾组织病理变化明显，且随着时间的延长逐渐加重，主要表现为肾小管上皮细胞脱落、变性，肾间质炎症细胞浸润及纤维化；各给药组大鼠肾组织病理变化在各时间点均明显轻于模型组，其中以益肾化瘀方正丁醇部位病变最轻。
　　（3）益肾化瘀方不同极性部位对UUO模型大鼠肾组织羟脯氨酸含量的影响与假手术组相比，模型组大鼠肾组织中羟脯氨酸的含量增加明显，并随时间的延长逐渐升高。与模型组相比，各给药干预组肾组织中羟脯氨酸含的量明显下降，且以益肾化瘀方正丁醇部位组和缬沙坦组下降最为显著，二者组间无统计学差异性(P＞0.05)。
　　（4）益肾化瘀方不同极性部位对UUO模型大鼠肾组织中FN表达变化的影响假手术组大鼠在整个实验过程中肾组织中FN无明显变化。模型组大鼠肾组织中FN明显升高，并随时间的延长，肾组织中FN逐渐升高。与模型组相比，各给药组肾组织中FN均有不同程度明显降低。
　　（5）益肾化瘀方不同极性部位对UUO模型大鼠肾组织中TGF-β1、BMP-7表达变化的影响假手术组大鼠肾组织中TGF-β1阳性表达极少；模型组大鼠肾组织中TGF-β1随着时间的延长表达明显增多；各给药干预组大鼠肾组织中在不同时间点TGF-β1的阳性表达明显均少于模型组，其中以益肾化瘀方正丁醇部位组效果最为明显，和缬沙坦组二者无统计学差异（P﹥0.05），BMP-7则相反。
　　结论：
　　1.采用系统溶剂提取法，成功获取益肾化瘀方石油醚部位、益肾化瘀方乙酸乙酯部位、益肾化瘀方正丁醇部位和益肾化瘀方水饱和部位。在4个极性部位中，益肾化瘀方正丁醇部位能够显著减轻UUO大鼠肾组织病理学损伤，并且降低UUO大鼠血清BUN、Scr、CysC水平，降低肾组织中羟脯氨酸含量，其作用与缬沙坦疗效相当，而其余3个极性部位的改善作用不甚明显，证实益肾化瘀方正丁醇部位具有较好的延缓肾间质纤维化作用。
　　2.益肾化瘀方正丁醇部位能够显著降低肾组织中FN含量，抑制大鼠肾组织中TGF-β1的表达、上调BMP-7的表达，表明其可以减少ECM的沉积,减轻肾间质纤维化的程度,具有拮抗肾间质纤维化的作用。
　　3.益肾化瘀方正丁醇部位可能是益肾化瘀方拮抗肾间质纤维化作用的有效部位。

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中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

（一）实验材料

（二）实验方法

（三）统计学处理

结果

1 大鼠一般情况

2大鼠死亡情况

3 各组大鼠不同时间点生化指标的变化

4 各组大鼠肾脏外观变化情况

5 各组大鼠肾脏病理变化情况

6各组大鼠不同时间点肾组织中羟脯氨酸含量变化

7各组大鼠不同时间点肾组织中FN表达变化

8 各组大鼠不同时间点肾组织中TGF-β1表达变化

9各组大鼠不同时间点肾组织中BMP-7表达变化

讨论

1实验动物模型的选择

2中药有效部位提取分离方法

3肾间质纤维化的发生机制

4肾间质纤维化的中医病因病机认识

5实验结果分析

结论

致谢

参考文献

附录1：附图

附录2：文献综述

附录3 在校期间论文论著和科研情况