粒细胞集落刺激因子诱导造血干细胞动员过程中对成骨细胞的影响

摘要

目的:粒细胞集落刺激因子诱导造血干细胞动员过程中对成骨细胞的影响
　　方法:本研究以C57BL野生型小鼠和人成骨细胞为研究对象，予C57BL野生型小鼠注射粒细胞集落刺激因子，应用流式细胞仪、骨髓免疫组化、ELISA法检测粒细胞集落刺激因子诱导造血干细胞动员前后不同时点的小鼠外周血和骨髓标本，观察骨髓成骨细胞在粒细胞集落刺激因子诱导造血干细胞动员前后的变化。粒细胞集落刺激因子及低氧模拟剂氯化钴(CoCl2)处理人成骨细胞，应用细胞计数试剂盒检测人成骨细胞的增殖，以明确低氧对人成骨细胞增殖的影响。荧光定量PCR检测经粒细胞集落刺激因子和CoCl2处理前后人成骨细胞骨保护素基因和破骨细胞分化因子基因相对表达量的水平。westernblot检测经粒细胞集落刺激因子和CoCl2处理前后人成骨细胞骨保护素、破骨细胞分化因子和低氧诱导因子-1α的蛋白表达水平，明观察低氧对人成骨细胞活性的影响。
　　结果:①粒细胞集落刺激因子诱导动员后小鼠外周血Lin-Sca1+cKit+细胞占有核细胞的比例中day5显著高于day0、day3(0.61±0.05％ VS0.04±0.01％、0.10±0.02％，P＜0.05)。②粒细胞集落刺激因子诱导动员过程中骨髓成骨细胞形态发生改变，形态由原来卵圆形变为扁平形、梭形。粒细胞集落刺激因子诱导动员后骨髓成骨细胞计数day5显著低于day0、day3（10.0±1.7 VS40.0±3.1、23.0±2.5， OB.N/B.s，P＜0.05）。③粒细胞集落刺激因子诱导动员后外周血OCN蛋白表达水平day3和day5显著低于day0(9.93±2.12ng/ml、9.46±1.66ng/ml VS23.21±2.17ng/ml,P＜0.05)④CoCl2处理人成骨细胞4h、24h、48h、72h、96h、144h的增殖率分别为0.487±0.018、0.830±0.040、1.482±0.034、1.736±0.047、2.141±0.052、2.515±0.049，对照组人成骨细胞相应时段的增殖率分别为0.614±0.019、0.988±0.025、1.628±0.049、2.000±0.038、2.363±0.040、2.741±0.075，粒细胞集落刺激因子处理人成骨细胞相应时段的增殖率分别为0.559±0.038、0.992±0.020、1.619±0.073、1.920±0.089、2.412±0.088、2.558±0.116，经CoCl2处理各时间段人成骨细胞的增殖率均显著低于对照组(P＜0.05)，经粒细胞集落刺激因子处理各时间段人成骨细胞的增殖率与对照组差别均无显著性意义(P＞0.05)。⑤实验组（100uM CoCl2培养48h）人成骨细胞骨保护素基因的相对表达量显著低于对照组（0.71±0.12 VS1.30±0.15，P＜0.05）。⑥实验组（100uM CoCl2培养48h）人成骨细胞破骨细胞分化因子基因的相对表达量显著低于对照组（0.84±0.02 VS1.06±0.03，P＜0.05）。⑦人成骨细胞经CoCl2处理后，骨保护素和破骨细胞分化因子蛋白表达水平下调，低氧诱导因子-1α蛋白表达水平显著上调。
　　结论:①粒细胞集落刺激因子诱导造血干细胞动员过程中成骨细胞数量和活性显著下降。②低氧可能是粒细胞集落刺激因子诱导造血干细胞动员过程中成骨细胞数量和活性显著下降的原因之一。③通过低氧抑制成骨细胞从而诱导HSC动员可能是G-CSF诱导HSC动员的重要机制之一。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

材料与方法

1 研究对象

2 主要试剂

3 主要仪器和设备

4 试剂配制

5 细胞培养和实验动物标本的采集和制备

6 流式细胞仪检测动员前后小鼠外周血LSK细胞比例

7 小鼠股骨组织病理学检查

8 ELISA测定HSC动员前后小鼠血清OCN的浓度

9 检测CoCl2和G-CSF对人成骨细胞增殖的影响

10 荧光定量PCR检测OPG基因和RANKL基因的相对表达量

11 Wrestern blot检测人成骨细胞OPG和RANKL的蛋白表达水平

12 统计学处理

结果

1 G-CSF诱导HSC动员过程中小鼠外周血LSK细胞构成比变化

2 G-CSF诱导HSC动员过程中骨髓成骨细胞形态学和数量改变

3 G-CSF诱导HSC动员过程中外周血OCN蛋白表达水平的变化

4 CoCl2以及G-CSF对人成骨细胞增殖率的影响

5 CoCl2对人成骨细胞RNAKL基因和OPG基因mRNA表达量的影响

讨论

小结

参考文献

英文缩写词及中文对照

综述 骨髓微环境低氧在造血干细胞动员中的作用的研究进展

致谢