癌-睾丸抗原CT23表达下调对胶质瘤细胞恶性生物学行为影响的体外研究

摘要

目的:探讨癌-睾丸抗原CT23对胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响。
　　方法:(1)用RT-PCR和免疫细胞化学方法筛选高表达CT23的胶质瘤细胞株;(2)用阳离子脂质体法将特异性CT23siRNA转染胶质瘤细胞，对siRNA转染条件进行优化，用RT-PCR和Western blot验证CT23干扰效率后，进行相关的实验;(3)CCK8法检测细胞的生长增殖能力;(4)流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况;(5)Western blot检测细胞周期蛋白A(cyclin A)、周期蛋白B(cyclin B)和凋亡相关蛋白caspase3的表达水平;(6)划痕修复实验、Transwell迁移实验观察细胞迁移能力;(7)TranswellMatrigel侵袭实验观察细胞侵袭能力、Western blot检测基质金属蛋白酶2(MMP2)和金属蛋白酶9(MMP9)表达水平;(8)通过Martrigel粘附检测细胞黏附能力。
　　结果:(1)确定胶质瘤细胞株U251MG和U87MG为实验对象;(2)经RT-PCR和Western blot检测，实验组较对照组CT23表达量明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01);(3)CCK-8法检测结果显示，下调CT23表达后，两株胶质瘤细胞增殖能力较对照组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01);(4)流式细胞仪检测细胞周期结果显示，胶质瘤细胞CT23表达下调后，S期细胞减少，G2/M期细胞增加(P＜0.01)，G0/G1期细胞所占百分数无统计学差异(P＞0.05);Western blot结果显示，CT23表达下调后周期蛋白cyclinA表达水平下降，与对照组比较其差异有统计学意义(P＜0.01)，CT23表达下调后周期蛋白cyclin B表达水平与对照组比较无统计学差异（P＞0.05）;(5)流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，CT23siRNA组的早期凋亡细胞百分比增加，与对照组比较其差异具有统计学意义(P＜0.01);Western blot结果显示，CT23表达下调后caspase3蛋白表达水平升高，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01);(6)划痕修复实验中，在12h时间点，两株胶质瘤细胞组间的修复率无统计学意义(P＞0.01);在24h时间点，CT23siRNA组的修复率较对照组明显降低，其差异具有统计学意义(P＜0.01);Transwell迁移实验显示，下调CT23表达可导致穿膜细胞数降低，与对照组具有统计学意义(P＜0.01);(7)Transwell Matrigel侵袭实验中，CT23siRNA组穿膜细胞数较对照组明显降低(P＜0.01);Western blot检测MMP2、MMP9的结果显示，下调CT23表达后两株胶质瘤细胞的MMP2、MMP9表达量均下降，与对照组比较具有统计学差异（P＜0.01）;(8)粘附实验结果显示，两株胶质瘤细胞在转染CT23siRNA后，其黏附能力均下降(P＜0.01)。
　　结论:CT23表达下调可减弱胶质瘤细胞细胞的恶性生物学行为，本研究为下一步的动物实验奠定基础，并提示将阻断CT23的表达方法用于胶质瘤的治疗具有潜在的临床应用价值。

目录

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英文缩略词索引

摘要

前言

材料与方法

1实验材料

1．1 细胞株

1．2 主要试剂

1．3 抗体

1．4 主要仪器设备

1．5 试剂及溶液配制

1．6 CT23 siRNA的设计与合成

2实验方法

2．1 常用设备的消毒

2．2 细胞培养

2．3 筛选高表达CT23的胶质瘤细胞株

2．4 siRNA转染条件优化

2．5 siRNA干扰效率检测

2．6 细胞增殖检测

2．7 细胞周期及细胞周期相关蛋白检测

2．8 细胞凋亡及凋亡相关蛋白的检测

2．9 细胞黏附能力检测

2．10 细胞迁移能力检测

2．11 细胞侵袭能力和侵袭相关蛋白检测

2．12 统计学方法

结果

1 胶质瘤细胞株U251MG、U87MG高表达CT23

2 siRNA转染条件优化

3 CT23 siRNA的干扰效率

4 下调CT23引起细胞增殖抑制

5 下调CT23阻滞细胞周期、抑制cyclin A表达

6 下调CT23诱导细胞凋亡、上调caspase 3表达

7 下调CT23引起细胞黏能力下降

8 下调CT23引起细胞迁移能力下降

9 下调CT23抑制细胞侵袭能力和MMP2、MMP9表达

讨论

1．CT23 RNA干扰的实验条件优化

2．抑制CT23表达对胶质瘤细胞生长、细胞周期和凋亡的影响

3．下调CT23对肿瘤细胞黏附、迁移和侵袭的影响

4．问题与展望

结论

参考文献

附录

综述

致谢

攻读学位期间发表的论文