脱氢表雄酮(DHEA)在维生素D转化代谢中的作用机制研究

摘要

本文内容分为三部分进行论述：
　　第一部分 人骨髓间充质干细胞体外培养与鉴定
　　目的：运用实验室已经成功创建的人骨髓间充质干细胞培养方案，分离、培养和鉴定hMSCs，为后续研究提供充足的干细胞来源。
　　方法：采用密度梯度离心法分离出单个核细胞，细胞贴壁法在α-MEM培养基中获得原代hMSCs，随后进行传代培养。对成骨细胞分化采用碱性磷酸酶活性检测和Alizarin Red S染色进行鉴定;对脂肪细胞分化应用OilRed-O染色方法进行鉴定;应用Alcian blue染色对软骨细胞分化进行鉴定。
　　结果：骨髓细胞培养6-24小时，胞体形状由圆形逐步变为三角型或不规则形状。培养第2-4天间充质细胞形态发生改变，细胞形态逐渐变为成纤维细胞样的梭型，并聚集成集落;培养7-14天，细胞长满培养瓶底面积的70％-80％，细胞排列更加紧密，此时的骨髓间充质干细胞为单层细胞。对细胞进行成脂诱导分化，可检测不同形状的Oil Red-O阳性染色细胞形成;成骨细胞诱导分化后，碱性磷酸酶活性检测，以及Alizarin Red S染色的阳性细胞形成;诱导成软骨细胞分化后可见Alcian blue染色阳性细胞形成。
　　结论：本试验采用的方法可以成功分离、培养及扩增人骨髓间充质干细胞，并鉴定其具有成骨、成脂、成软骨分化能力。
　　第二部分 DHEA上调IGF-Ⅰ基因表达并促进hMSCs向成骨分化
　　目的：本研究验证DHEA是否通过调节IGF-Ⅰ从而促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。
　　方法：采用不同时间点、不同浓度DHEA药物刺激人骨髓间充质干细胞，进行时间和浓度依赖试验，并采用生物化学和小分子酶抑制剂去阐明DHEA在人骨髓间充质干细胞中调节IGF-Ⅰ基因表达并促进其向成骨分化的机制。在本实验研究，应用PKA信号通路抑制剂H-89，PKC信号通路抑制剂CHE，JNK信号通路抑制剂SP600125分别阻断PKA信号通路，PKC信号通路，JNK信号通路。应用PI3K信号通路抑制剂LY294002，P38 MAPK信号通路阻断剂SB203580， P42/44信号通路阻断剂PD098059，IGF-IR受体阻断剂AG1024分别阻断PI3K、P38 MAPK、P42/44 MAPK、IGF-IR信号通路。
　　结果：在骨髓间充质干细胞中，DHEA可上调IGF-Ⅰ基因表达，并且存在时间和浓度依赖。IGF-Ⅰ基因表达高峰期是在DHEA刺激后4-6小时;在刺激时间为6小时情况下，最佳药物浓度为10nM。阻断PI3K，P38 MAPK，P42/44 MAPK信号通路，DHEA上调IGF-1基因表达的作用被抑制。随后样本经特殊酶抑制剂作用后，对成骨分化相关基因和碱性磷酸酶检测均出现表达降低。
　　结论：DHEA可能经过IGF-Ⅰ信号通路，包括PI3K，P38 MAPK，P42/44MAPK信号通路来上调人骨髓间充质干细胞中IGF-Ⅰ基因表达并促进其向成骨方向分化。
　　第三部分
　　目的：研究老龄化与1α-羟化酶关系，并阐明DHEA在维生素D代谢中的作用机制。
　　方法：运用RT-PCR方法研究在人骨髓间充质干细胞中维生素D代谢关键酶1α-羟化酶的表达，并且分析年龄对其表达的影响。应用IGF-IR受体阻断剂AG1024，CERB阻滞剂KG501分别阻断IGF-1，CERB信号通路，从蛋白水平研究DHEA在维生素D转化代谢中的作用机制。
　　结果：一组包括19例患者的样本中，年龄从40到87岁，平均年龄56±11岁，研究发现随着年龄的增长，CYP27B1/1α-羟化酶的表达逐渐下降。老年组（年龄＞55岁，n=12）CYP27B1/1α-羟化酶表达是年轻组CYP27B1/1α-羟化酶表达（年龄＜50岁，n=7）的64.4％。
　　在老年组和年轻组中，我们通过RT-PCR分别对25OHD3或1，25(OH)2D3±DHEA对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响进行研究。在年轻组中，成骨诱导培养3d后，我们发现25OHD3，1，25(OH)2D3，DHEA均可以促进成成骨相关标志基因的表达，如碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)。但在老年组中，25OHD3对相关成骨标志基因刺激作用较弱。在老年组中，经DHEA预处理后，25OHD3和1，25(OH)2D3均可以诱导人骨髓基质干细胞向成骨方向分化。
　　在人骨髓基质干细胞中，通过不同的小分子抑制剂的应用，发现cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CR EB)和IGF-Ⅰ分别介导了脱氢表雄酮调节CYP27B1的作用。通过应用小分子抑制剂AG-1024（一种IGF-IR的抑制剂），发现脱氢表雄酮上调CYP27B1的表达都是通过IGF-Ⅰ的激活。而通过应用小分子抑制剂KG-501（特殊抑制CREB的下游基因），发现脱氢表雄酮上调CYP27B1的表达同样需要通过CREB的激活。由此推测CYP27B1上调则是由于DHEA激活的IGF-Ⅰ信号系统，继发激活CREB所介导的。
　　结论：1α-羟化酶/CYP27B1的表达及活性随着人年龄的增长而下降。脱氢表雄酮可能上调IGF-Ⅰ，从而激活CREB，最终上调CYP27B1，增强人骨髓间充质干细胞对于25OHD3的反应能力，从而增强其成骨分化能力。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

第一部分 人骨髓间充质干细胞体外培养与分化鉴定

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分 DHEA上调IGF-Ⅰ基因表达并促进hMSCs向成骨分化

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

第三部分 DHEA对人骨髓间充质干细胞中维生素DR化代谢的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

缩略词表

攻读博士期间发表的论文

综述