柠檬醛对鸡胚唇部组织形态发育和成纤维细胞生长因子8时空表达的影响

摘要

目的：本研究通过载体微珠将柠檬醛植入正常发育的20期鸡胚鼻窝组织中，建立鸡胚唇裂模型;制备地高辛标记的成纤维细胞生长因子8(FGF8) RNA探针，通过整胚原位杂交的方法检测鸡胚唇部发育和唇裂发生过程中FGF8基因时空表达的变化，探索FGF8在唇裂发生中机理，为早期发现预防唇裂提供理论依据。
　　方法：1.FGF8 RNA探针的制备本实验应用Marion Wassef PhD惠赠的鸡FGF8/pBluescript KSⅡ(+)重组质粒，EcoRⅠ、XhoⅠ限制性内切酶酶切得到线性化DNA模板，利用pBluescript KSⅡ(+)载体中的T3、T7RNA聚合酶上的启动子，体外转录合成地高辛标记的FGF8正、反义RNA探针。探针的合成为后续的整胚原位杂交试验做好了准备。
　　2.各个时期鸡胚的收集将正常发育的20期鸡胚随机分为3组，分别是实验组、阴性对照组、正常空白对照组。实验组（CT组）:20期鸡胚右侧鼻窝外胚层上植入携带0.6g/mL浓度的柠檬醛微珠;阴性对照组(DMSO组):20期鸡胚右侧鼻窝外胚层植入浸泡于DMSO中的微珠;空白对照组:20期鸡胚未经任何处理。3组分别收集20期至28期每期5只鸡胚。
　　3.整胚原位杂交检测FGF8基因mRNA的时空表达通过整胚原位杂交的方法检测鸡胚唇部发育和唇裂发生过程中FGF8基因的时空表达变化。
　　结果：1、体外成功转录获得正、反义鸡的FGF8 RNA探针。
　　2、正常组、DMSO组和CT组正常侧三者唇部发育无明显差别。正常组、DMSO组和CT组正常侧鸡胚20期微珠植入1h后，鼻板凹陷形成浅窝;22期时面部各突起已经形成，由额鼻突、侧鼻突、上颌突围成鼻窝;24期内外侧鼻突与上颌突围成的鼻缝较宽，并与下颌突一起围成了口凹;随时间推移，各突起逐渐发育并接触融合，两侧对称边缘连续。20期+1h CT组实验侧未观察到明显异常;22期开始观察到上颌突、侧鼻突出现发育异常，上颌突及内外侧鼻突发育缺损，体积较正常组明显缩小，突起融合发生障碍。
　　3、FGF8的表达在鸡胚颌面部呈动态性，正常组、DMSO组和CT组正常侧三者颌面部FGF8的表达无明显差别。正常组、DMSO组和CT组正常侧中可观察到20期+1h时FGF8在额鼻区和鼻窝内侧边缘广泛高表达，上颌突的下缘和尾端及下颌突的外侧上缘也呈高表达;随着颌面部的发育，22期FGF8的表达局限在额鼻突中央、内侧鼻突、上颌突下缘及下颌突的上缘;内侧鼻突的表达在24期扩展至外侧鼻突，额鼻突中央及下颌突表达消失;24期后FGF8的表达开始下降，28期FGF8在突起接触融合处表达明显降低甚至消失。20期+1h CT组实验侧FGF8的表达未观察到明显异常;22期至24期侧鼻突FGF8的表达较正常组、DMSO组和CT组正常侧下降;26期及28期侧鼻突与上颌突融合处FGF8的表达较正常组、DMSO组和CT组正常侧高。
　　结论：1、制备的FGF8反义RNA探针具有较高的特异性，能有效的检测FGF8基因的表达。
　　2、柠檬醛可影响鸡胚唇部组织FGF8的表达，FGF8表达的变化影响鸡胚唇部的发育，提示FGF8在唇部发育和唇缺损畸形发生过程中具有重要作用。

目录

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个人简历

摘要

前言

第一节 地高辛标记的鸡胚FGF8基因RNA探针的制备

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二节 柠檬醛对鸡胚唇部组织FGF8的时空表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

6 问题和展望

参考文献

附录

综述

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文