氧化应激对蛋白磷酸酶2A催化亚基甲基化调控作用的研究

摘要

蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase2A，PP2A)是一种在细胞内重要而又普遍表达的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，它由结构亚基（A亚基）、调节亚基（B亚基）和催化亚基（C亚基）三部分组成的，其中催化亚基自身修饰的变化对PP2A全酶的调控具有重要作用。研究表明，PP2A催化亚基甲基化改变与多种细胞进程相关;目前有研究提示PP2A是一种氧化敏感型蛋白，但在氧化应激下其催化亚基是否发生甲基化修饰的变化目前还不清楚。H2O2是细胞内主要的活性氧自由基，既可直接造成生物大分子物质的氧化应激，也可作为第二信使，参与氧化应激相关信号传导途径调控。因此研究H2O2在细胞分子传导、蛋白调控过程中是否能引起PP2A催化亚基修饰的改变，特别是甲基化改变，对深入认识氧化应激机制，寻找氧化损伤的防治靶点具有重要理论及现实意义。
　　研究目的：
　　1、观察氧化应激作用下细胞内PP2A催化亚基甲基修饰变化情况。
　　2、探讨与氧化应激作用下PP2A催化亚基甲基变化相关的机制。
　　研究方法：
　　选用小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3细胞)和人上皮成纤维细胞(HPF细胞)为受试细胞。用0.1、1、5、10、25mmol·L-1的H2O2染毒处理NIH/3T3细胞，检测H2O2诱导氧化应激过程中细胞活性变化、去甲基PP2Ac以及总PP2Ac的表达等指标的变化，比较各组指标变化的差异;使用PME-1抑制剂AMZ30和抗氧化剂NAC拮抗H2O2的氧化应激作用，检测NIH/3T3细胞的活性变化、去甲基PP2Ac以及总PP2Ac的表达等指标的变化;激光共聚焦扫描技术定位NIH/3T3细胞内去甲基PP2Ac、总PP2Ac在正常情况、氧化应激、PME-1抑制剂拮抗氧化应激和抗氧化剂拮抗氧化应激下等情况下的变化;激光共聚焦扫描技术定位HPF内去甲基PP2Ac、总PP2Ac、PME-1、LCMT在正常情况、氧化应激、PME-1抑制剂拮抗氧化应激和抗氧化剂拮抗氧化应激下的变化情况;探讨PP2Ac甲基化调控在H2O2致氧化应激过程中的相关机制。
　　研究结果：
　　结果显示，0.1-25mmo1·L-1H2O2对NIH/3T3细胞活性产生明显的抑制作用(P＜0.01)。使用不同浓度H2O2刺激NIH/3T3细胞1h后各组细胞内的去甲基化PP2Ac表达增多，其中1、5mmol·L-1组与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)，但总PP2Ac的表达在各组无统计学意义(P＞0.05)。使用不同浓度的NAC及AMZ30拮抗H2O2作用，结果显示，0.1-1 mmol·L-1NAC及5-10μmol·L-1 AMZ30均能拮抗1mmol·L-1 H2O2诱导的PP2Ac去甲基化作用，NAC可恢复受抑制的细胞活性，而AMZ30对H2O2造成的细胞活性抑制未见显著影响。激光共聚焦扫描发现H2O2诱导细胞核内与胞浆中的去甲基化PP2Ac表达增加，且核内/胞浆比例较空白对照组明显降低;使用NAC拮抗H2O2后PME-1和去甲基化PP2Ac的核内/胞浆比例较单纯H2O2刺激时有明显提高;使用AMZ30拮抗H2O2后PME-1和去甲基化PP2Ac的核内/胞浆比例与单纯H2O2刺激时相似;总PP2Ac与LCMT的变化在各组间均未有统计学差异。
　　研究结论：
　　1、H2O2诱导细胞内PP2Ac去甲基;抗氧化剂NAC和PME-1抑制剂AMZ30均能拮抗H2O2对PP2Ac的去甲基作用。
　　2、H2O2刺激后细胞内PP2Ac甲基化修饰核质分布发生改变，核质比下降。抗氧化剂NAC可逆转H2O2诱导的PP2Ac去甲基化核质比异常，PME-1抑制剂AMZ30未见这种逆转作用。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

第一章 ：氧化应激对NIH／3T3细胞内PP2Ae甲基化的影响

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果

1．3．1 刃天青测定细胞活性变化

1．3．2 Western blot测定NIH／3T3细胞内去甲基化PP2Ae的变化

1．4 讨论

第二章 ：甲基化PP2Ac及其调控酶胞核胞质分布

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．3．1 NIH／3T3细胞去甲基PP2Ac和PP2Ac在氧化应激刺激时胞核胞质分布

2．3．2 HPF细胞去甲基PP2Ac和总PP2Ac在氧化应激刺激时胞核胞质分布

2．3．3 HPF细胞PME-1在氧化应激刺激时胞核胞质分布

2．3．4 HPF细胞LCMT在氧化应激刺激时胞核胞质分布

2．4 讨论

全文结论

参考文献

附录

综述

攻读硕士学位期间发表的论文

攻读硕士学位期间参与的课题

攻读硕士学位期间获得的奖励

致谢