miR-146a靶基因IRAK1，TRAF6及其相关lncRNA HOXA11-AS对肺癌的作用及机制研究

摘要

目的：
　　肺癌是全世界癌症死亡的重要原因。其发病率和死亡率位居恶性肿瘤之首。肺癌常常在晚期才被确诊，因此丧失了有效的治疗机会。即使部分患者早期手术治疗后，其复发率仍然居高不下。肺癌的传统治疗手段包括手术、放疗、化疗及综合治疗等，而目前新兴的治疗手段是分子靶向治疗。其中以靶向EGFR为代表的分子靶向药物问世以来，让肺癌的治疗效果上升了一个新台阶。但即使这些靶向药物能提高肺癌治疗效果，其5年生存率仍然改观不大，而且靶向药物受益人群有限。因此，急需为肺癌的诊断和治疗寻求有效的新靶标。
　　本课题组的前期研究表明，微小RNA-146a(microRNA-146a，miR-146a)低表达于肺癌组织及细胞系中，其可能为肺癌的抑癌miRNA，通过靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)发挥作用。但除了EGFR外，miR-146a是否还有其他靶基因？且miR-146a在肺癌中的具体作用机制也仍未清楚。
　　长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一种长度大于200个核苷酸的非编码RNA。LncRNA是调控各种细胞生物过程的重要因素，包括了进行X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等过程。近年来，研究发现许多LncRNA异常表达于人类恶性肿瘤，作为癌基因或抑癌基因调控肿瘤的生物学功能。课题组前期生物信息学预测发现，miR-146a与lncRNA HOXA11-AS存在结合位点。而HOXA11-AS与肿瘤关系的研究未见相关报道。结合课题组前期工作，生物信息学预测结果，我们推测HOXA11-AS可能下调miR-146a表达，并调控其下游基因包括IRAK1、TRAF6和EGFR及NF-KB信号通路，进而参与肺癌的发生、发展和转移等机制。本课题侧重研究miR-146a潜在靶基因IRAK1及TRAF6在肺癌中的作用以及miR-146a相关lncRNA HOXA11-AS对肺癌生物学形状的影响，并进一步探讨HOXA11-AS作为分子靶向治疗靶点的潜能。
　　方法：
　　1.miR-146a靶蛋白IRAK1、TRAF6在肺癌中的表达及作用
　　1.1使用real time RT-qPCR检测65例肺癌组织的miR-146a表达水平，同时使用免疫组织化学方法检测IRAK1及TRAF6的表达，对比miR-146a与IRAK1，TRAF6的关系。
　　1.2使用LipofectamineTM2000转染miR-146amimic、miR-146a inhibitor、IRAK1siRNA、TRAF6siRNA和EGFR siRNA继而研究miR-146a及其靶基因IRAK1，TRAF6在肺癌A549和H460细胞系中的生物学功能。
　　1.3采用免疫组织化学法，研究IRAK1和TRAF6在另一组标本中的表达（肺癌组织，n=365，正常肺组织，n=30），并分析其与临床病理参数的关系。
　　2.miR-146a相关HOXA11-AS对肺癌细胞恶性表型的影响
　　2.1采用实时荧光定量qRT-PCR方法，检测HOXA11-AS在肺癌组织(n=6)及细胞系(A549、H460、H1299和和PC9)的表达情况。
　　2.2构建HOXA11-AS RNAi的慢病毒载体，转染A549、H460、H1299和PC9四株肺癌细胞系，以获得稳定的低表达HOXA11-AS的细胞系。
　　2.3通过人工细胞计数、CCK8、流式细胞术、Transwell迁移和侵袭等实验，检测敲除HOXA11-AS表达对肺癌细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、迁移和侵袭能力的影响。
　　2.4使用鸡胚绒毛尿囊膜成瘤(chick chorioallantoic membrane，CAM)实验，探讨HOXA11-AS对CAM肿瘤形成和血管生成的影响。
　　3.通过双荧光素酶报告基因实验，验证miR-146a与HOXA11-AS在A549肺癌细胞系中靶向结合关系。
　　结果：
　　1.miR-146a靶蛋白IRAK1、TRAF6在肺癌中的表达增高并发挥促癌作用
　　1.1在65例肺癌组织中，miR-146a表达水平与IRAK1、TRAF6均呈明显负相关关系。
　　1.2体外实验表明，敲除A549和H460肺癌细胞的miR-146a表达，可促进细胞增殖和抑制细胞凋亡;而过表达miR-146a则结果相反，明显抑制细胞的恶性行为。利用siRNA干扰技术，沉默肺癌细胞中的IRAK1和TRAF6表达后，结果与使用miR-146a mimic效果类似，均能明显抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡。
　　1.3IRAK1在肺癌组织中的表达明显高于正常肺组织(p=0.002)，其表达水平与临床TNM分期(r=0.241，p＜0.001)、肿瘤大小(r=0.279，p＜0.001)及淋巴结转移(r=0.299，p＜0.001)均相关。同时，TRAF6在肺癌组织中的表达也明显高于正常肺组织(p＜0.001)。Spearman相关分析表明，其表达水平与临床TNM分期(r=0.241，p＜0.001)、肿瘤大小(r=0.279，p＜0.001)及淋巴结转移(r=0.299，p＜0.001)均相关。
　　2.HOXA11-AS可促进肺癌细胞的增殖并抑制凋亡
　　2.1.本研究首次证实，LncRNA HOXA11-AS在肺癌组织中的表达要高于癌旁肺组织，且其表达在肺癌细胞系中也高于正常支气管上皮细胞系，但仍需大样本的验证。
　　2.2.人工细胞计数并绘制生长曲线，显示敲除HOXA11-AS表达后其细胞增殖能力率明显低于对照组(p＜0.001)。
　　2.3体外实验表明，转染HOXA11-AS RNAi的肺癌细胞系，其细胞的迁移和侵袭能力均被抑制(p＜0.01)。
　　2.4流式细胞术结果表明，敲除HOXA11-AS后其细胞的凋亡率明显高于对照组(p＜0.01)。
　　2.5下调HOXA11-AS表达后，其细胞周期阻滞于G0/G1或G2/M期，而S期则明显减少(p＜0.01)。
　　2.6敲除HOXA11-AS表达后，能明显抑制CAM的肿瘤形成的大小(p＜0.05)及其血管生成(p＜0.01)。
　　3.双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-146a能特异性结合HOXA11-AS3'UTR端，而明显下调A549肺癌细胞的荧光素酶活性。证实了HOXA11-AS与miR-146a存在靶向关系。
　　结论：
　　1.结合课题组前期研究结果，IRAK1及TRAF6为miR-146a在肺癌中的靶蛋白。miR-146a通过靶向IRAK1及TRAF6而发挥抑制细胞增殖及促进凋亡的生物学作用。
　　2.HOXA11-AS在肺癌组织及细胞系中表达增高;HOXA11-AS可能扮演癌基因的角色，在肺癌细胞增殖、迁移和侵袭方面发挥重要作用。
　　3.HOXA11-AS可能是miR-146a的“海绵”，能靶向结合miR-146a后抑制其在肺癌的表达水平。
　　4.HOXA11-AS/miR-146a/IRAK1，TRAF6，EGFR信号通路可能在肺癌的发生发展和转移中发挥重要作用。但仍需进一步实验证实，该通路其有望为肺癌的诊断、治疗及预后判断等提供新思路。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

参考文献

第一部分MiR-146a靶蛋白IRAK1及TRAF6在肺癌中的表达及作用

引言

材料与方法

1．实验材料

2．主要试剂

3．主要仪器

4．实验方法

结果

讨论

参考文献

第二部分miR-146a相关HOXA11-AS在肺癌中的表达及对肺癌细胞恶性表型的影响

引言

材料与方法

1．实验材料

2．主要试剂

3．主要仪器

4．实验方法

5．统计分析

结果

讨论

参考文献

第三部分：肺癌中HOXA11-AS与miR-146a靶向结合关系的研究

引言

材料与方法

1．荧光素酶实验

2．细胞培养

3．细胞转染步骤

4．统计分析

结果

讨论

全文讨论和总结

综述

缩略语表

致谢

攻读学位期间发表的论文

附件：发表的SCI全文