Agkihpin原核重组融合蛋白的分离纯化和活性探究

摘要

目的：
　　分离纯化蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin重组融合蛋白，研究该融合蛋白酶生物学活性及影响酶活性因素，以及对正常肝细胞和肝癌细胞生长的影响。
　　方法：
　　1.连接有His6-Agkihpin目的基因的工程菌BL21(DE3)在IPTG的诱导作用下表达目的蛋白，SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达的目的蛋白。
　　2.(1)运用Ni2+亲和层析凝胶柱法分离纯化His6-Agkihpin重组融合蛋白，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度;(2)以TAME为反应底物测定纯化得到的His6-Agkihpin重组融合蛋白的精氨酸酯酶活性;(3)运用不同温度、pH、金属离子、蛋白酶抑制剂作用分离纯化后的His6-Agkihpin重组融合蛋白并检测其活性变化情况;(4)以蝮蛇粗毒、生理盐水、天然Agkihpin做对照，分别用卵磷脂平板和琼脂糖-纤维蛋白平板测定His6-Agkihpin的PLA2活性及纤溶活性;(5)37℃水浴条件下，把His6-Agkihpin重组融合蛋白与0.4％的纤维蛋白原溶液混合，SDS-PAGE鉴定其对纤维蛋白原的作用。
　　3.体外培养正常肝细胞L-02及肝癌细胞BEL-7404，用不同浓度的His6-Agkihpin重组融合蛋白分别作用72h后，通过CCK8法研究其对正常肝细胞L-02及肝癌细胞BEL-7404的细胞毒性活力检测，并观察细胞形态的改变及对细胞迁移力的影响。
　　结果：
　　1.经IPTG诱导，在SDS-PAGE凝胶上约30KDa处出现明显蛋白条带，Western Blot鉴定，在相应的位置出现了His6-Agkihpin重组融合蛋白条带，且均显示得到的His6-Agkihpin重组融合蛋白是包涵体蛋白。
　　2.Ni2+亲和层析凝胶柱法分离纯化His6-Agkihpin重组融合蛋白，经SDS-PAGE鉴定，在约30KDa处出现了蛋白条带，且达到了电泳纯;透析法复性纯化得到的蛋白后，用TAME底物法测定其精氨酸酯酶的活性，得到比活力为8.723U/mg。
　　3.经过不同的温度、pH、金属离子、蛋白酶抑制剂条件作用下，发现(1)His6-Agkihpin重组融合蛋白在37℃、pH为8.0的条件下精氨酸酯酶活性最高;(2)几种不同的金属离子均对His6-Agkihpin重组融合蛋白的精氨酸酯酶活性有增强的作用，其中Ca2+作用最明显;(3)EDTA对其酶活性有明显的抑制作用，PMSF其次，而DTT跟β-巯基乙醇对酶活性抑制作用不大。
　　4.卵磷脂平板法测定His6-Agkihpin重组融合蛋白的PLA2活性，发现蝮蛇粗毒、天然跟Agkihpin重组融合蛋白孔周围均出现透明圈，都有PLA2活性。
　　5.琼脂糖-纤维蛋白平板法对His6-Agkihpin的纤溶活性测定，发现蝮蛇粗毒、天然Agkihpin跟Agkihpin重组融合蛋白孔周围均出现水解透明圈，都有纤溶活性。
　　6.SDS-PAGE鉴定不同水浴时间里，His6-Agkihpin重组融合蛋白具有水解纤维蛋白原的活性，主要对纤维蛋白原的α带有水解作用，且从0.5h时就开始水解，水浴8h，α带被完全水解。
　　7.0.207～4.13μg/ml浓度的His6-Agkihpin重组融合蛋白作用BEL-7404细胞后，各加药实验组跟对照组相比细胞活力下降明显(P＜0.01)，细胞活力随His6-Agkihpin浓度增加而减弱（r=0.808，P＜0.05），细胞活力抑制率为11.69％～48.52％;浓度为1.033～4.13μg/ml的His6-Agkihpin对人肝癌BEL-7404细胞的增殖有明显的抑制作用(P＜0.05)，加药24h、48h、72h后增殖抑制率分别为20.47％～76.76％、56.36％～79.38％和11.79％～45.44％，且剂量依赖作用明显(P＜0.05);浓度为3.23μg/ml和4.13μg/ml的His6-Agkihpin对BEL-7404细胞还有一定的杀伤作用，杀伤率分别为19.73％和50.22％;浓度为0.207～4.13μg/ml的His6-Agkihpin对人肝癌BEL-7404细胞的迁移也有明显的抑制作用，作用24h时，抑制率为8.7±0.52％～52.58±7.8％，作用48h时，抑制率为11.49±0.89％～92.43±7.46％，且抑制作用跟浓度成正比（r=0.759，P＜0.05）。
　　8.0.207～4.13μg/ml浓度的His6-Agkihpin重组融合蛋白作用L-02细胞后，对细胞活力、细胞增殖和迁移有一定的促进作用。
　　结论：
　　1.分离纯化得到了电泳纯的His6-Agkihpin重组融合蛋白。
　　2.His6-Agkihpin重组融合蛋白的活性受温度和pH值的影响。37℃，pH8.0时，His6-Agkihpin重组融合蛋白的活性最高。
　　3.His6-Agkihpin重组融合蛋白具有精氨酸酯酶、PLA2活性、水解纤维蛋白原活性、纤溶活性及类凝血酶活性。
　　4.His6-Agkihpin重组融合蛋白酶是一种金属蛋白，其活力受金属离子影响，其中Ca2+对酶活性促进最大，EDTA以对酶活性抑制作用最明显。
　　5.一定剂量的His6-Agkihpin重组融合蛋白可抑制人肝癌BEL-7404细胞株的细胞活力、增殖和迁移，而对正常肝细胞L-02的细胞活力、增殖和迁移有一定的促进作用。

目录

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个人简历

英汉缩略对照表

摘要

前言

第一部分 蛇毒精氨酸酯酶His6-Agkihpin重组融合蛋白的表达及鉴定

1 材料与方法

2、结果

3、讨论

第二部分 蛇毒精氨酸酯酶His6-Agkihpin重组融合蛋白的分离纯化和理化性质研究

1 材料与方法

2、结果

3、讨论

第三部分 His6-Agkihpin重组融合蛋白对肝癌细胞及正常肝细胞生长的影响

1 材料与方法

2、结果

3、讨论

第四部分 实验结论

参考文献

附录

综述

致谢

硕士在读期间发表的论文