腹泻型肠易激综合征大鼠模型中差异表达microRNA的筛选及miRNA-490-5p对类胰蛋白酶的影响

摘要

目的:通过生物信息学分析，在腹泻型肠易激综合征大鼠模型中筛选出感兴趣的miRNAs分子。针对感兴趣的miRNA，通过构建miRNA-490-5p慢病毒载体，研究miRNA-490-5p对类胰蛋白酶的影响，并探讨其可能的机制，以深入阐明microRNA在腹泻型肠易激综合征的发生发展中的重要性，也为腹泻型肠易激综合征的诊断和治疗提供新的思路。研究共分为二部分:一、腹泻型肠易激综合征大鼠模型中差异表达microRNA的筛选及验证;二、腹泻型肠易激综合征大鼠模型中miRNA-490-5p对类胰蛋白酶的影响。
　　方法：
　　一、腹泻型肠易激综合征大鼠模型中差异表达microRNA的筛选及验证在miRDB数据库中对本课题组前期人结肠组织IBS-D/N组miRNA芯片筛选出的差异表达显著的72个miRNAs进行目标microRNA的筛选;用乙酸灌肠加束缚应激的方法构建IBS-D大鼠模型，分别为正常对照组（正常组）8只、造模组（IBS-D组）16只，两组均采用结肠敏感性检测及腹壁撤离反射(AWR)评分对其内脏敏感性进行评估并检测两组大鼠的粪便性状及胃肠通过时间，同时行H&E染色评价结肠粘膜组织学改变;取结肠组织对目标microRNAs通过qRT-PCR进行验证。
　　二、腹泻型肠易激综合征大鼠模型中miRNA-490-5p对类胰蛋白酶的影响
　　健康wistar大鼠29只，随机分为4组，分别为正常对照组（正常组）5只、IBS-D组（造模组）8只、慢病毒空载体对照组（空载组）8只、慢病毒miRNA-490-5p沉默组（沉默组）8只，采用乙酸灌肠加束缚应激的方法制造IBS-D大鼠模型;模型评估方法同方法一;构建慢病毒miRNA-490-5p沉默载体和慢病毒空载体，通过大鼠尾静脉注射慢病毒及空载体，10天后处死大鼠，取结肠粘膜组织用H&E染色评价结肠粘膜组织学改变，实时荧光定量PCR检测慢病毒干预后miRNA-490-5p的表达量，通过免疫组织化学法检测类胰蛋白酶的表达量。
　　结果：
　　一、腹泻型肠易激综合征大鼠模型中差异表达microRNA的筛选及验证
　　1.在miRDB数据库共筛选出4个目标microRNA: miR-143-5p、miR-490-5p、miR-204-5p、miR-29b-1-5p。
　　2.IBS-D大鼠的粪便Bristol性状评级为5-7级，与正常组对比，造模组大便湿重及大便含水量明显增高，大鼠腹部收缩反射的最小阈值较正常组低，肠道传输时间较正常组短，上述指标差异具有统计学意义(p＜0.05)。在0.8ml、1.2mi、1.6ml结肠容量扩张时，造模组大鼠腹部收缩次数明显高于正常组，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
　　3.H&E染色结果显示:正常组和造模组大鼠的结肠组织炎症Kruschewski评分为0-1分，未见明显炎症。
　　4.qRT-PCR结果:与正常组相比，造模组结肠组织中rno-miR-143-5p、rno-miR-490-5p的表达下降，而rno-miR-143-5p、rno-miR-490-5p的表达量上调，差异均具有统计学意义(p＜0.05)。
　　二、腹泻型肠易激综合征大鼠模型中miRNA-490-5p对类胰蛋白酶的影响
　　1.大鼠IBS-D模型建模评估指标结果显示:正常组大鼠粪便Bristol性状评级为3-4级，造模组、空载组、沉默组大鼠粪便Bristol性状评级为5-7级;与正常组相比，其余各组大鼠的粪便含水量明显增多，粪便肠道通过时间明显缩短，结肠扩张腹壁反射最小注水阈值减小(P＜0.05)。
　　2.qRT-PCR结果显示:沉默组的miR-490-5p比造模组、正常组及空载组的表达量显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　3.H&E染色:四组大鼠结肠组织炎症Kruschewski评分为0-1分，均无明显炎症反应，大鼠造模成功结肠黏膜组织结构正常。
　　4.免疫组化法结果显示:沉默组分别与空载组、造模组、正常组比较，其类胰蛋白酶的表达量均下降，且差异均有显著性统计学意义(P＜0.05);正常组分别与空载组、造模组比较时，其类胰蛋白酶的表达量下降，且差异均有显著性统计学意义(P＜0.05)。
　　结论：
　　1.IBS-D大鼠模型构建成功。
　　2.大鼠体内存在4个microRNAs(miR-143-5p、miR-490-5p、miR-204-5p、miR-29b-l-5p)，且在腹泻型肠易激综合征中miR-143-5p、miR-490-5p的表达量上调，miR-204-5p、miR-29b-1-5p表达下调，提示mircoRNA可能参与腹泻型肠易激综合征的发生发展。
　　3.miR-490-5p调节肠黏膜类胰蛋白酶表达，可能在IBS-D的发病机制中发挥一定的作用。

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摘要

英文缩略词

前言

第一部分 腹泻型肠易激综合征大鼠模型中差异表达microRNA的筛选及验证

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

第二部分 腹泻型肠易激综合征大鼠模型中miRNA-490-5p对类胰蛋白酶的影响

1 实验材料

2 实验方法

3．实验结果

讨论

结论

参考文献

文献综述 microRNA和Th17细胞在肠易激综合症中的作用

致谢

硕士期间发表论文