MTB脂蛋白G在HEK293T细胞中的表达和IL-23R基因多态性与肺结核易感性的研究

摘要

第一部分、MTB脂蛋白G在HEK293T细胞中的表达
　　目的:结核病是威胁全球人类公共卫生安全的传染性疾病，结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌，脂蛋白在结核分枝杆菌的致病性中起着重要的作用。本研究利用真核表达载体pcDNA3.1，构建含结核分枝杆菌(MTB)脂蛋白G(LprG)基因的真核表达载体pcDNA3.1-Hi s-LprG-FLAG，并在HEK293T细胞中表达和纯化LprG融合蛋白。
　　方法:以MTB标准株H37Rv的基因组DNA为模板，利用聚合酶链反应(PCR)法扩增出LprG基因。通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1-His-LprG-FLAG，重组载体经过酶切鉴定和测序分析成功后进行质粒转染。将重组质粒转染HEK293T细胞后，应用Western blot法检测His-LprG-FLAG融合蛋白的表达。达到一定的蛋白表达量后，利用Ni-NTA金属亲和层析柱从细胞上清和细胞裂解液中纯化融合蛋白His-LprG-FLAG，并用SDS-PAGE和Western blot法检测纯化后的蛋白。
　　结果:
　　1.成功地构建了pcDNA3.1-His-LprG-FLAG的真核表达载体。
　　2.Western blot结果表明转染质粒后，HEK293T细胞裂解液中检测目的蛋白，相对分子量（Mr）为27000。
　　3.经Ni-NTA金属亲和层析柱纯化后得到高纯度的融合蛋白His-LprG-FLAG。
　　结论:成功构建真核表达载体pcDNA3.1-His-LprG-FLAG，并在HEK293T细胞中表达和纯化了His-LprG-FLAG融合蛋白。
　　第二部分、IL-23R基因多态性与肺结核易感性的研究
　　目的:白介素23是一种重要的细胞因子，白介素23受体在许多免疫系统疾病发挥作用。该研究通过实验组和对照组，探讨华东地区人群白介素23受体基因rs11805303位点与肺结核病的遗传易感性，从而获得有意义的单倍型。
　　方法:随机选取200例上海市肺科医院健康体检者作为对照组，筛选同时期上海市肺科医院肺结核患者211例。聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析白介素23受体基因rs11805303位点单核苷酸多态性，DNA测序验证PCR-RFLP的分析结果。测序结果与PCR-RFLP结果符合后，计算基因型和等位基因频率。计算其哈温平衡。卡方检验分析分析白介素23受体基因rs11805303位点基因型及等位基因频率在病例组与对照组之间的分布差异。进一步，校正性别和年龄混杂因素后，采用Logistic回归分析，计算OR值和95％CI。从而确定基因型和等位基因属于危险因素还是保护因素。对照组与实验组白介素23受体血清水平差异采用方差分析。统计分析采用SPSS16.0软件分析，单倍型分析采用SHEsis在线软件。
　　结果:
　　1.计算实验组和对照组白介素23受体基因rs11805303位点的基因型频率，结果符合哈-温平衡。说明实验组和对照组具有群体代表性(P＞0.05)。
　　2.白介素23受体基因rs11805303位点有TT、TC、CC三种基因型。三种基因型及其等位基因在实验组与对照组分布频率差异无统计学意义。Logistic回归分析，经过校正年龄、性别因素后，以CC基因型作为参照，CT基因型增加了肺结核的患病风险[odds ratio(OR)=1.966，95％confidence interval(CI)=1.177-3.286，P=0.01];显性模型、TT基因型和T等位基因未发现与肺结核的患病风险相关。
　　3.对性别分层后，在男性人群中，与IL-23R基因rs11805303位点C等位基因比较，IL-23R基因rs11805303位点T等位基因与肺结核并无相关性（OR=1.672，95％CI=0.721-2.773，P=0.21）;与IL-23R基因rs11805303位点CC基因型比较，IL-23R基因rs11805303位点CT+TT基因型与肺结核患病风险无关(odds ratio(OR)=1.948，CI=1.439-3.910，P=0.25);与IL-23R基因rs11805303位点CC基因型比较，IL-23R基因rs11805303位点CT基因型与肺结核患病风险相关(oddsratio(OR)=1.878,CI=1.296-3.981,P=0.04);与IL-23R基因rs11805303位点CC基因型比较，IL-23R基因rs11805303位点TT基因型与肺结核患病风险无关(odds ratio(OR)=1.218，CI=0.934-3.679，P=0.07)。而女性人群中与IL-23R基因rs11805303位点C等位基因比较，IL-23R基因rs11805303位点T等位基因与肺结核并无相关性(OR=1.944,95％CI=0.019-3.837,P=0.43);与IL-23R基因rs11805303位点CC基因型比较，IL-23R基因rs11805303位点CT+TT基因型与肺结核患病风险无关(odds ratio(OR)=1.389，CI=1.783-3.481，P=0.69);与IL-23R基因rs11805303位点CC基因型比较，IL-23R基因rs11805303位点CT基因型与肺结核患病风险无关(oddsratio(OR)=1.610,CI=1.483-3.100,P=0.17);与IL-23R基因rs11805303位点CC基因型比较，IL-23R基因rs11805303位点TT基因型与肺结核患病风险无关(odds ratio(OR)=1.830，CI=0.591-3.372，P=0.06)。
　　结论:
　　1.白介素23受体基因rs11805303位点CT基因型可能是肺结核患病的危险因素。
　　2.在性别分层后，男性人群中IL-23R基因rs11805303位点CT基因型可能是肺结核患病的危险因素;男性人群其他基因型和女性人群中CC、CT和TT基因型以及C和T等位基因均与华东地区人群肺结核无相关性。

目录

声明

个人简历

摘要

第一部分 MTB脂蛋白G在HEK293T细胞中的表达

前言

材料和方法

嚣圜

讨论

结论

参考文献

综述一 结核杆菌壁脂蛋白调控巨噬细胞信号通路研究进展

第二部分 IL-23R基因多态性与肺结核易感性的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述二 IL-23R基因多态性及肺结核易患性的研究进展

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文