眼镜蛇毒NGF通过PI3K/Akt和TGF-β/Smad信号通路对HSC-T6细胞的影响

摘要

目的:对现有广西眼镜蛇毒NGF分离纯化方法进行优化，以获得高活性高纯度的NGF。研究NGF通过PI3K/Akt、TGF-β/Smad信号通路诱导HSC-T6细胞凋亡的机制，为NGF应用于肝纤维化的预防与治疗提供理论依据
　　方法:
　　(1)采用DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换层析柱、shephadexG-50分子组、Macro Prep High S阳离子预装柱对眼镜蛇毒NGF进行分离纯化;
　　(2) PC12细胞测定各层析柱洗脱峰的NGF活性，再利用SDS-PAGE电泳测定具有NGF活性洗脱峰的相对分子质量;
　　(3) CCK-8法分别检测NGF（终浓度分别为0.1、0.5、1、2、4μg/ml）和PI3K/Akt信号通路的特异性抑制剂LY294002(50μmol/L)和TGF-β/Smad信号通路特异性抑制剂LY2157299（50μmol/L）对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的增殖、增殖抑制率的影响;
　　(4)采用流式细胞技术检测NGF的有效浓度、LY294002和LY2157299对HSC-T6凋亡的影响;
　　(5) Western-Blot检测在NGF作用不同时间后(0、5、10、30、60、120min和24h)，PI3K/Akt、TGF-β/Smad信号通路中Akt、Smad3的磷酸化水平变化;
　　(6) Western-Blot分别检测用最小有效浓度NGF、PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002（50μmol/L）、以及NGF联合LY294002分别作用细胞后信号通路中Akt的磷酸化水平变化;NGF、TGF-β/Smad信号通路抑制剂LY2157299（50μmol/L）、NGF联合LY2157299分别作用细胞后信号通路中Smad3的磷酸化蛋白表达水平;
　　(7)Western-Blot检测当用LY2157299后对Akt蛋白磷酸化水平的影响，用LY294002后Smad3的磷酸化水平的变化。
　　结果:
　　(1)眼镜蛇毒经DEAE Sepharose CL-6B离子胶柱分离广西眼睛蛇毒分离出3个峰，前两个为穿透峰，最后一个为洗脱峰，最后一个峰具有NGF活性;shephadex G-50分离上一步第3峰，NGF活性在第二峰;MacroPrep High S阳离子胶预装柱对具有NGF的第二峰进行再分离得到3个峰;
　　(2)PC12细胞鉴定各个峰发现Macro Prep HighS分离的第3峰后半部分具有NGF活性;SDS-PAGE检测NGF为电泳纯，非还原性电泳分子量为23KD，还原性电泳为14KD; NGF得率为0.24％;
　　(3)CCK8结果显示NGF在浓度为1、2、4μg/ml时能够抑制HSC-T6细胞增殖，与空白组相比各组的抑制率均具有统计学意义（P＜0.01);信号通路抑制剂对HSC-T6细胞具有增殖抑制作用（P＜0.01）;
　　(4)流式细胞仪检测得出1、2、4μg/ml的NGF和抑制剂作用细胞24小时后，各组产生不同的凋亡率，与空白组相比均有统计学意义(P＜0.01);且随着NGF浓度的增加凋亡率逐渐升高;NGF的最小有效浓度为1μg/ml;
　　(5)各个时间段内的Akt，Smad3的磷酸化水平均低于正常组（P＜0.05），在NGF作用时间超过30min时Akt、Smad3蛋白磷酸化水平随着NGF作用时间增长而逐渐降低。
　　(6)p-Akt的表达量空白组＞NGF组＞LY294002组＞NGF+LY294002组，p-Smad3的表达量空白组＞NGF组＞LY2157299＞NGF+LY2157299组。且各组与空白组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　(7)LY2157299作用细胞后，PI3K/Akt信号通路中p-Akt/Akt的表达量依次为空白组＞ NGF组＞LY2157299＞ NGF+ LY2157299组，且与空白组差异具有统计学意义(P＜0.05)。LY294002作用细胞后，TGF-β/Smad信号通路中p-Smad3/Smad3的表达量依次为空NGF组、LY294002、NGF+LY294002组均低于空白组，且与空白组比较差异具有统计学意义（P＜0.01），但是实验组之间变化不大差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论:
　　(1)利用DEAE Sepharose CL-6B+Sephadex G-50+Macro-prepHighS分离出电泳纯、具有高生物活性的NGF。
　　(2)NGF可能通过调节能影响HSC-T6活化的信号通路PI3K/Akt、TGF-β/Smad电的关键蛋白Akt、Smad3磷酸化蛋白表达量，抑制HSC-T6的增殖。
　　(3)NGF能通过降低PI3 K/Akt、TGF-β/Smad中Akt、Smad3的磷酸化表达水平来诱导HSC-T6细胞的凋亡。
　　(4)PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002也能抑制Smad3的磷酸化蛋白表达，TGF-β/Smad抑制剂LY2157299也能抑制Akt磷酸化蛋白表达。PI3K/Akt、TGF-β/Smad两条通路之间在HSC-T6凋亡机制中可能具有相互协同作用。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

1．1 材料

1．2 实验方法

1．3 统计学方法

2 结果

2．1 NGF分离纯化层析结果图

2．2 PC12鉴定结果图

2．3 SDS-PAGE电泳

2．4 NGF在不同浓度下作用HSC-T6的增殖抑制率

2．6 WB检测最小有效浓度NGF作用HSC-T6后在不同时间段Akt、Smad蛋白的磷酸化水平的表达

2．7 WB检测PI3K／Akt抑制剂LY294002对Akt磷酸化水平的影响

2．8 WB检测TGF-β／Smad抑制剂LY2157299对Smad3磷酸化水平的影响

2．9 WB检测TGF-β／Smad与PI3／Akt信号通路抑制剂分别对Akt、Smad3磷酸化蛋白表达水平的影响

3 讨论

3．1 NGF的分离纯化方法的优化

3．2 NGF对HSC-T6具有增殖抑制、促凋亡作用

3．3 NGF通过PI3K／Akt信号通路对HSC-T6增殖、凋亡的影响

3．4 NGF通过TGF-I3／Smad信号通路对HSC-T6增殖、凋亡的影响

3．5 PI3K／Akt与TGF-β／Smad信号通路的相互作用

4 结论

参考文献

附录 主要缩略词

综述 肝星状细胞的主要信号通路与肝纤维化

致谢

在读期间发表论文情况