H3N2亚型SIV感染人A549细胞和猪PAM细胞后病毒生物学特性变化及miRNA表达

摘要

目的:
　　利用H3N2亚型猪流感病毒SW2783（重组有pdm/09H1N1内部基因）和SW650(未重组有pdm/09H1N1内部基因)分别感染人肺腺癌细胞A549（简称人A549细胞）和猪肺泡巨噬细胞PAM（简称猪PAM细胞），研究病毒感染人和猪细胞后病毒的生物学特性变化，以及SW2783感染人细胞相关miRNA93和miRNA192表达，为猪流感病毒跨种属感染人分子机制的研究提供线索。
　　方法:
　　1.用本实验室分离鉴定的H3N2亚型SIV SW2783和SW650分别感染人A549细胞和猪PAM细胞，观察病毒感染人A549细胞和猪PAM细胞后的细胞病变(CPE)、血凝实验(HA)和半数组织培养感染量(TCID50)，比较SW2783和SW650分别感染人和猪细胞后病毒复制的差异和毒力的改变。
　　2.荧光定量PCR检测SW2783和SW650分别感染人A549细胞后miRNA93和miRNA192的表达。
　　3.Western blot检测SW2783和SW650分别感染人A549细胞后病毒蛋白NP、HA的表达。
　　4.ELISA检测病毒感染人A549细胞后IFN-β的分泌。
　　结果:
　　1.SW2783和SW650分别在人A549细胞和猪PAM细胞上进行适应性感染实验，TCID50和HA显示SW2783在人A549细胞和猪PAM细胞上的感染呈现逐步适应的过程，提示SW2783可能具有跨种属感染人的潜在能力，而SW650在以上两种细胞的适应性过程中显示出感染能力下降的趋势，甚至丧失感染能力，提示SW650感染人A549细胞和猪PAM细胞的能力有限;CPE实验也呈现相似趋势，24h时开始出现CPE，但在48h时CPE最为明显，72h时细胞大量死亡，提示在这两株病毒的适应性感染过程中，可能存在某些特殊miRNA，进而对病毒的复制能力和感染能力有所影响。
　　2.荧光定量PCR显示，SW2783感染人A549细胞后，感染组与阴性对照组相比，miRNA192和miRNA93的表达在感染后48h时最高，差异有统计学意义(p=0.0020;p=0.0050);SW650感染人A549细胞后，与阴性对照组相比，miRNA93的表达在72h时最高，差异有统计学意义(p=0.0007)，而对于miRNA192，在48h时表达最高，差异也有统计学意义(p=0.0020);之后将SW2783和SW650感染人A549细胞，在加入miRNA93及miRNA192抑制剂之后，抑制剂组与感染组miRNA93和miRNA192的表达量相比，均显著下降。
　　3.Western blot显示，SW2783感染人A549细胞后，病毒NP和HA蛋白的表达在24h时最高，感染组与阴性对照组相比，差异有统计学意义(p=0.0000;p=0.0000);SW650感染人A549细胞后，病毒NP和HA蛋白的表达在48h时最高，与阴性对照组对比，差异有统计学意义(p=0.0000;p=0.0000);加入miRNA93抑制剂，SW2783感染人A549细胞后48h，对于病毒NP和HA蛋白的表达，抑制剂感染组较抑制剂对照组均有所上调，差异有统计学意义(p=0.0006;p=0.0000);加入miRNA192抑制剂，SW2783感染人A549细胞后48h，抑制剂感染组与抑制剂对照组的病毒NP的表达相比，差异无统计学意义，但与HA蛋白表达对比，前者显著下调，差异有统计学意义(p=0.0002);SW650感染人A549细胞48h，加入miRNA93抑制剂后，抑制剂感染组的NP表达较抑制剂对照组有所上调，差异有统计学意义(p=0.0400)，而对于HA蛋白的表达，抑制剂对照组与抑制剂感染组相比较，差异无统计学意义;加入miRNA192抑制剂后，抑制剂感染组与抑制剂对照组相比，HA蛋白的表达有所提高，NP反而下调，差异有统计学意义(p=0.0000)。
　　4.炎症因子的实验结果显示:SW2783、SW650分别感染人A549细胞后在8h、48h和72h三个时间点，抑制剂对照组与未感染组相比，IFN-β表达水平都呈上调趋势;加miRNA93抑制剂后，SW650感染人A549细胞过程中的抑制剂组与抑制剂对照组相比，IFN-β表达水平显著升高，48h的IFN-β表达水平最高，差异有统计学意义(p=0.0020);SW2783感染人A549细胞过程中的抑制剂组与抑制剂对照组相比，IFN-β表达水平显著升高，抑制剂组在48h IFN-β表达水平最高，且差异有统计学意义(p=0.0004)。
　　结论:
　　1.SW2783是一株在人A549细胞和猪PAM细胞上能够进行复制增殖的H3N2亚型猪流感病毒，说明该病毒具有感染人和猪呼吸道细胞的亲嗜性，且具有潜在感染人的能力;而SW650作为一株未重组有pdm/09H1N1内部基因的H3N2亚型的猪流感病毒，对于人A549和猪PAM细胞的感染能力都有限。
　　2.miRNA93参与SW2783和SW650NP合成调节，而miRNA93只参与SW2783HA蛋白合成调节，但对SW650HA蛋白合成调节无明显影响;miRNA192则对SW650HA蛋白合成有正调节作用，但它对SW2783HA蛋白和NP合成有负调节作用。
　　3.下调miRNA93可以靶向流感病毒的RNA，使病毒复制增加和毒力增强，而且能促进病毒感染的宿主细胞分泌炎症因子IFN-β。

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英文缩略语表

摘要

研究背景

第一部分 H3N2亚型SIV毒株感染人A549细胞和猪PAM细胞后病毒生物学特性变化

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5．小结

第二部分 H3N2亚型SIV感染人肺腺癌细胞A549后miRNA93、miRNA192的研究

1．材料

2．方法

3 结果

4 讨论

5 小结

全文小结

创新性发现

参考文献

综述 流感病毒与microRNA(miRNA)的研究进展

附录

致谢

资助项目

攻读硕士学位期间发表的论文