小鼠巨细胞病毒感染的免疫应答和致病机制研究1)小鼠播散性巨细胞病毒感染后肺免疫细胞CD11c表达模式；2)小鼠母体巨细胞病毒感染对胎盘和胎脑血清素代谢通路的影响

摘要

目的： 1.利用小鼠播散性MCMV感染模型，测定病毒感染后肺组织细胞CD11c和特异性表面标记的表达，以分析各种免疫细胞独特的CD11c表达模式；进一步对比观察BALB/c和C57BL/6两种鼠系的差异性，以寻找CD11c表达模式与免疫细胞功能以及MCMV慢性化之间的潜在关系。 2.建立孕前和孕期MCMV感染小鼠模型，评定胎盘和胎脑重量改变，并测定胎盘母体免疫激活相关细胞因子基因转录水平，以明确MCMV感染所致母体免疫激活与子代神经精神异常的潜在相关性；测定胎盘和胎脑血清素合成和代谢通路各关键酶，并观察胎盘组织血清素表达及其改变，以明确MCMV相关mIA对胎盘和胎脑血清素代谢通路的影响。 方法： 第一部分小鼠播散性巨细胞病毒感染后肺免疫细胞CD11c表达模式 1.小鼠播散性巨细胞病毒感染模型的建立：雌性BALB/c小鼠，4.5周龄，腹腔接种MCMV Smith毒株（5×103）PFU，建立播散性感染模型，同时设立正常对照组；同步设置C57BL/6小鼠MCMV感染组及其正常对照组； 2.收获MCMV感染后1、3、5、7天各组小鼠肺组织，制作单细胞悬液，抗体标记CD11c和其他特异性细胞表面分子，流式细胞学检测法测定各组CD11c阳性表达细胞；同时收集各组小鼠外周血和脾脏单个细胞悬液，分析自然杀伤细胞（NK）和T细胞表面的CD11c表达模式。 第二部分小鼠母体巨细胞病毒感染对胎盘和胎脑血清素代谢通路的影响 1.建立BALB/c小鼠孕期急性巨细胞病毒感染模型（acuteMCMV infectiondruing pregnancy,a-MCMV），同时设立孕前巨细胞病毒感染组（pre-pregnancy MCMV infection,p-MCMV)、LPS对照组（LPS）和正常对照组。其中，LPS对照组分设高中低三个剂量亚组，分别注射50μg/kg、25μg/kg和1.5μg/kg的LPS； 2.自孕栓检出日为胚胎日龄（embryonic day,E）第0.5天，即E0.5d；于E13.5d、E14.5d及E18.5d收集小鼠胎盘和胎脑组织，评估各实验组胎盘和胎脑组织均重；胎盘组织石蜡包埋，H&E染色评估其病理学改变。 结果： 第一部分小鼠播散性巨细胞病毒感染后肺免疫细胞CD11c表达模式 1.CD11cint细胞群的流式细胞学鉴定：由于前期研究于MCMV感染后7天（7dpi）观察到肺组织显著增多的CD11c表达量中等细胞群（CD11cintMHC II?/loCD86?/lo）。为了对其进行鉴定，采用NKp46、CD3ε、CD19、Ly6G、F4/80和Siglec H分别标记NK cells、T cells、B cells、中性粒细胞、巨噬细胞和浆细胞样DCs（pDCs）。结果显示，正常组CD11cint细胞群主要由NK cells（NKp46+CD3ε?）和T cells（CD3ε+NKp46?）构成；MCMV感染后肺组织CD11cintT细胞大量扩增，构成7dpi主要的CD11cint细胞群；而CD11cintT细胞经进一步标记确定为CD8a+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）； 2.肺组织MCMV特异性CD8+T细胞分析：MCMV感染后7天，约10%的CD8+T细胞为MCMV-m164特异性细胞（正常组低于1%）；几乎所有的tetramer+CD8+T细胞（即MCMV-m164特异性T细胞）均为CD11cint细胞； 3.肺组织T细胞的CD11c表达模式及其在BALB/c和C57BL/6两种不同近交系小鼠中的比较：CD4+T细胞在MCMV感染前后均为CD11c无表达或低表达；而CD8+T细胞（CTLs）由CD11c?和CD11cint两个亚群组成。正常组，CD11c?细胞占CTLs的绝大多数（C57BL/6比例稍高于BALB/c，约90%vs80%）；MCMV感染后C57BL/6和BALB/c均能观察到CD11cintCTLs的显著增多（可占到80%~85%）；而C57BL/6能够诱导更高水平（占肺组织总细胞含量的40%~50%vs BALB/c20%~30%）的CTLs扩增（主要是CD11cintCTLs的扩增）； 4.脾脏和外周血CTLs的CD11c表达模式：MCMV感染均能诱导感染后7天脾脏和外周血CD11cintCTLs的显著扩增，且C57BL/6可诱导更为剧烈的CTLs扩增。 第二部分小鼠母体巨细胞病毒感染对胎盘和胎脑血清素代谢通路的影响 1.胎盘和胎脑均重分析：与正常组相比，孕期急性MCMV感染和50μg/kg LPS刺激均可导致胎盘和胎脑重量的显著减低。LPS低剂量组（25μg/kg和1.5μg/kg）组织重量减低情况较LPS50μg/kg组轻微。p-MCMV组未观察到显著的组织重量减轻，E18.5d胎盘重量甚至高于正常组； 2.胎盘组织病理学分析：LPS组和MCMV组（含a-MCMV和p-MCMV组）均可观察到不同程度的炎症改变，以E13.5d为甚。在LPS50μg/kg组，主要的病理改变是坏死，部分坏死灶可伴有出血。而a-MCMV组，除了坏死之外，还可在交界区观察到炎症细胞的浸润。p-MCMV组仅见轻微的坏死改变。E18.5d时LPS50μg/kg组表现出迷路区血管密度和分支程度的显著降低，而a-MCMV组血管密度仅略有下降； 3.胎盘母体免疫激活相关细胞因子IL-6和IL-10的mRNA表达：孕期急性MCMV感染可以导致E13.5d胎盘IL-6转录水平的显著上调（相较于正常组，P＜0.05），于24小时后恢复到正常水平。相反，LPS50μg/kg组在E13.5d和E14.5d可观察到IL-6mRNA水平的下调，其中，E14.5d显著低于正常组（P＜0.05）。各实验组各时间点胎盘IL-10的mRNA水平相对稳定； 4.胎盘血清素代谢通路的改变：孕期急性MCMV感染可以显著上调胎盘各时间点血清素合成酶TPH1和DDC的基因表达，而不改变血清素降解酶Mao-A以及转运蛋白SERT的表达。LPS50μg/kg组可以短暂上调E13.5d胎盘TPH1和DDC的转录水平，同样不影响Mao-A及SERT表达。p-MCMV和LPS1.5μg/kg组均未观察到胎盘各代谢相关酶和SERT的基因表达的改变。而LPS25μg/kg组虽未观察到各时间点代谢相关酶的改变，但SERT于E14.5d显著高于正常组； 5.胎脑血清素代谢通路的改变：孕期急性MCMV感染对胎脑血清素合成限速酶TPH2和转运蛋白SERT的基因表达无明显改变。而p-MCMV组则可以显著降低E14.5d胎脑TPH2和SERT的mRNA水平。此外，LPS50μg/kg组可以明显升高妊娠晚期（E18.5d）TPH2和SERT的mRNA表达水平。LPS1.5μg/kg组的胎脑TPH2和SERT表达与正常组无异； 6.胎盘血清素的表达和组织分布：正常组胎盘，5-HT在蜕膜、交界区、迷路区、绒毛膜板和卵黄囊各层均有不同程度表达。其中，5-HT在迷路区呈现零星分布。E13.5d时，a-MCMV组和LPS50μg/kg组胎盘均表现出迷路区显著增多5-HT表达，而其他区域无明显增多。 结论： 第一部分小鼠播散性巨细胞病毒感染后肺免疫细胞CD11c表达模式 1.MCMV感染后可诱导绝大部分CTLs表达CD11c，这种CD11c的表达可能是CTLs高活化状态和潜在高抗病毒效应的一种表现； 2.BALB/c和C57BL/6小鼠的NK细胞和CTLs显示出了不同的CD11c表达模式，这种差异可能与相应免疫细胞独特的抗病毒能力相关；相对于BALB/c小鼠，C57BL/6能够诱导强而持续的NK细胞应答，继而是更为强烈的CTLs反应，有利于MCMV病毒的快速清除； 3.B220+CD11cint NK细胞可能是一种抗MCMV感染更为有效的NK细胞亚群。 第二部分小鼠母体巨细胞病毒感染对胎盘和胎脑血清素代谢通路的影响 1.孕期急性MCMV感染可致妊娠中期胎盘IL-6mRNA表达上调，从而从动物模型上证实母体MCMV感染与子代神经精神异常的潜在相关性； 2.不同母体免疫激活状态对胎盘和胎脑血清素代谢系统的影响不同：孕期急性MCMV感染可造成胎盘持续性5-HT合成酶转录增加，在引发胎盘5-HT水平增多的同时可能对胎脑的关键发育事件造成影响；孕期50μg/kg LPS刺激可短暂上调胎盘的5-HT合成，并影响妊娠晚期胎脑的5-HT合成酶及转运蛋白的表达；而孕前MCMV感染，虽对胎盘5-HT合成无影响，但可下调妊娠中期胎脑5-HT合成酶及转运蛋白的基因表达。

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