RADA16--I中共培养对脐带间充质干细胞增殖及成牙分化能力的影响

摘要

目的: 探讨不同浓度(1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.125％)RADA16-Ⅰ多肽自组装水凝胶支架对人牙髓细胞(human dental pulp cells，hDPCs)和人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)生长和增殖能力的影响，探索最佳水凝胶浓度。利用RADA16-Ⅰ水凝胶构建三维培养环境，将人脐带间充质干细胞和人牙髓细胞进行共培养，评估牙髓细胞对脐带间充质干细胞的牙向诱导分化作用，为后续的相关研究建立实验基础。 方法: 实验一水凝胶中三维培养对细胞增殖的影响:选择生长状态良好的第4～6代hDPCs、hUCMSCs与水凝胶混合制备水凝胶-细胞复合体;倒置相差显微镜下拍片并记录各组细胞生长形态;分别于培养第3、6、9、12天采用MTT法检测细胞的增殖状况，绘制细胞生长曲线并做统计学分析。综合分析，确定适用于后续实验的最佳水凝胶浓度。 实验二hUCMSCs、经BMP-2诱导成牙分化后的hDPCs、BMP-2以及水凝胶构建三维共培养体系:分为hDPCs组、hUCMSCs与hDPCs共培养组、hUCMSCs组。培养第1、3、6、9、12天，采用MTT法检测细胞活性并绘制细胞生长曲线;培养第7、14天检测各组ALP活性，提取RNA进行RT-PCR检测成牙本质相关基因DSPP、DMP-1、ALP、OCN mRNA的表达情况;培养第21天后行茜素红染色，检测矿化结节形成情况。 结果: 细胞在水凝胶中三维培养呈团状生长，而二维培养组呈扁平梭形生长，为典型的成纤维细胞形态。MTT结果显示:①二维培养细胞在3～6天进入对数生长期，6天后进入平台期。②hUCMSCs和hDPCs都能在水凝胶中稳定生长:hUCMSCs在水凝胶中经过几天的潜伏适应期，第6～9天进入对数生长期;而hDPCs对数生长期为第3～6天，6天后增殖速度减缓。③间充质干细胞能在水凝胶支架中正常生长和增殖，低浓度水凝胶中hUCMSCs和hDPCs的增殖能力较高浓度者更强(P＜0.05)。综合考虑细胞相容性及水凝胶的结构稳定性，我们选择0.25％的水凝胶用于后续实验。 水凝胶中三维共培养组的细胞增殖活性、ALP活性及矿化结节生成能力均高于两种细胞的单独培养组(P＜0.05)。RT-PCR结果显示，共培养组在基因(DSPP、DMP-1、ALP、OCN)mRNA的表达高于hUCMSCs组，接近于hDPCs单独培养组，某些时刻甚至超过hDPCs单独培养组。 结论: RADA16-Ⅰ水凝胶具备良好的生物相容性，综合评价筛选出浓度为0.25％的水凝胶进行后续实验。 水凝胶与1∶1混合的hDPCs、hUCMSCs构建的水凝胶-细胞复合体能在BMP-2诱导的环境下，保持良好的生长和分化，牙向分化和矿化能力甚至超过同等生长环境的hDPCs单独培养组，说明共培养系统中，细胞的增殖与分化受到某种程度上的调控。