重组水蛭素对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的作用及其机制的初步研究

摘要

目的: 通过研究重组水蛭素对动脉粥样硬化巨噬细胞浸润和炎症的作用，以及对动脉粥样硬化斑块中B型清道夫受体CD36、TLR4和NF-κB表达的影响，从而探讨重组水蛭素对动脉粥样硬化的作用，为其在临床上的应用提供理论依据。 方法: 给予ApoE-/-小鼠高脂饲料喂养10周，建立经典动脉粥样硬化小鼠模型。将模型小鼠随机分为模型组(Model)、重组水蛭素(recombinant hirudin，RHD)低剂量组(0.25mg·kg-1·d-1，ip)、RHD中剂量组(0.5mg·kg-1·d-1，ip)、RHD高剂量组(1.0mg·kg-1·d-1，ip)、瑞舒伐他汀组(2.5mg·kg-1·d-1，po)，每组8只;另设8只C57BL/6J小鼠作为正常组(Control)，给予等体积生理盐水(ip)。连续给药8周，全程观察小鼠一般情况，检测体重变化。观察指标:全自动生化分析仪检测小鼠血清脂质水平;透射电镜下观察主动脉血管壁超微结构;进行主动脉大体油红O染色观察小鼠主动脉脂质斑块形成情况;HE染色法观察小鼠主动脉病理学改变情况，Masson染色观察主动脉胶原改变情况。ELISA法测定小鼠血清炎性因子;CD68、α-SMA免疫组化染色观察主动脉斑块中巨噬细胞浸润和平滑肌肌动蛋白分布情况;实时荧光定量PCR和免疫组织化学染色法用于检测小鼠主动脉组织中TLR4、NF-κB和CD36的表达水平。 结果: 1.重组水蛭素对ApoE-/-小鼠血清脂质水平的影响 血脂检测结果显示，模型组小鼠血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平较正常组均显著升高(P＜0.01);与模型组比较，重组水蛭素各剂量组TC、TG和LDL-C水平均有不同程度的降低(P＜0.05或P＜0.01);HDL-C方面，各给药组与模型组无统计学差异(P＞0.05)。 2.重组水蛭素对ApoE-/-小鼠主动脉血管病理学的影响 透射电镜:模型小鼠内皮细胞内含大量脂泡、线粒体出现肿胀和空泡性病变;重组水蛭素干预后，内皮细胞内脂泡减少、线粒体情况改善。油红O染色:正常组主动脉血管壁光滑无脂质沉积，模型组小鼠主动脉可见大量连续的脂质斑块;与模型组比较，重组水蛭素各剂量组粥样斑块均减少。HE染色:与正常组比较，模型组血管内皮明显增生增厚，粥样斑块形成，皮下可见大量胆固醇结晶、巨噬-泡沫细胞和坏死组织;干预后，重组水蛭素各剂量组内皮增生情况减轻，皮下泡沫细胞减少。Masson染色:模型组主动脉血管胶原异常增生，重组水蛭素各剂量组胶原含量均有不同程度减少。 3.重组水蛭素对ApoE-/-小鼠血清TNF-α、IL-6、CRP的影响 与正常组比较，模型组小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、CRP水平显著增加（P＜0.01）;与模型组比较，重组水蛭素各剂量组小鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平均降低，差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。 4.免疫组化法观察粥样斑块巨噬细胞浸润和α-SMA分布 CD68、α-SMA免疫组化染色结果显示，模型组粥样斑块可见大量CD68表达和α-SMA少量表达;重组水蛭素各剂量组粥样斑块CD68表达减少α-SMA表达增加(P＜0.05或P＜0.01)。 5.重组水蛭素对ApoE-/-小鼠CD36mRNA和蛋白表达的影响 RT-PCR和免疫组化研究结果显示，与正常组比较，模型组小鼠主动脉CD36mRNA和蛋白表达显著增加（P＜0.01）;与模型组比较，重组水蛭素各剂量组CD36mRNA和蛋白的表达均减少（P＜0.05或P＜0.01）。 6.重组水蛭素对ApoE-/-小鼠主动脉TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达的影响 RT-PCR和免疫组化研究结果显示，与正常组比较，模型组小鼠主动脉TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达明显增加(P＜0.01);与模型组比较，重组水蛭素各剂量组TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达减少（P＜0.05或P＜0.01）。 结论: 1.重组水蛭素能够降低ApoE-/-小鼠血清脂质水平。 2.重组水蛭素能够抑制ApoE-/-小鼠血管内皮增生、减少巨噬细胞浸润、抑制巨噬-泡沫细胞形成、增加平滑肌肌动蛋白含量、减少胶原纤维增生。 3.重组水蛭素能够降低ApoE-/-小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、CRP水平。 4.重组水蛭素可减少CD36、TLR4/NF-κB表达，从而改善主动脉粥样硬化慢性炎症反应、抑制泡沫细胞形成，抑制AS发展。