血管紧张素Ⅱ受体在蒽环类药物心脏毒性反应中的作用及抗肿瘤活性研究

摘要

化疗是目前恶性肿瘤常用的治疗手段，也是除手术、放疗以外最为有效的治疗方式，阿霉素(doxorubicin，DOX)是蒽环类药物中的一种，有效并广泛应用于白血病、骨髓瘤、卵巢癌、子宫内膜癌及乳腺癌等多种恶性肿瘤，但心脏毒性是其所致且不可避免的副反应，并且对合并有心脏疾病的患者而言就显得尤为突出及重要。因此，如何更早期预警并发现蒽环类药物所致心脏毒性，并及时采用有效措施来预防或保护心肌，是目前临床上亟待解决的问题。在心血管系统的生理病理调节过程中发挥重要作用的是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)，其起的生理病理作用主要是通过血管紧张素Ⅱ结合其两个最主要受体亚型——血管紧张素Ⅱ1型受体(AngiotensinⅡType1 Receptor，AT1R)和血管紧张素Ⅱ2型受体(AngiotensinⅡ Type2 Receptor，AT2R)来介导的。AT1R、AT2R在心肌细胞损伤与修复中起重要作用，并被证实在多种恶性肿瘤中高表达，与肿瘤的增殖、凋亡密切相关。
　　缬沙坦（valsartan，VAT）是血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(angiotensiureceptor blocker，ARB)，属于RAS阻滞剂中的一种，ARB选择性作用AT1受体，促进心脏功能恢复，而对心肌细胞具有保护作用。越来越多的临床试验研究表明，ARB同时具有减少心肌细胞凋亡等作用，AT1R、AT2R逐渐成为研究抗肿瘤药物的新靶点。本研究通过构建心肌细胞损伤模型，筛选最佳阿霉素作用浓度及时间，通过缬沙坦来研究AT1R、AT2R在阿霉素诱导的心肌细胞损伤中的作用，并将阿霉素与缬沙坦联合作用于子宫内膜癌细胞（HEC-1A、ISHIKAWA），观察AT1R、AT2R基因通过RAS/RAF/ERK/BAX/B CL-2信号通路对肿瘤细胞增殖、凋亡的影响。
　　第一部分 心肌细胞损伤模型的建立
　　目的：建立心肌细胞损伤模型，为后续研究打下基础。
　　方法：应用DOX处理H9C2心肌细胞建立DOX心肌损伤模型。CCK-8比色法测定细胞存活率;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Real-time PCR法检测不同浓度DOX处理H9C2心肌细胞后细胞中AT1R、AT2R mRNA表达情况。
　　结果：以0.25-16μmol/L倍比递增浓度的DOX处理H9C2细胞12h、24h产生的毒性反应呈剂量及时间依懒性。其中1μmol/L的DOX在24h能明显引起心肌细胞损伤，使细胞存活率下降至（75.5±5.6）％，细胞凋亡率达到(11.94±2.07)％;随着DOX剂量的增加心肌细胞中AT1R、AT2R mRNA表达上升。
　　结论：成功建立DOX诱导的心肌细胞损伤模型。
　　第二部分 缬沙坦对阿霉素诱导心肌细胞损伤的保护作用
　　目的：探讨缬沙坦在阿霉素诱导心肌细胞毒性反应中的作用。
　　方法：根据DOX所致H9C2心肌细胞损伤模型，利用CCK-8比色法测定细胞存活率，筛选出缬沙坦最佳饱和浓度后进行实验分组;Control组、DOX组、DOX+VAT组、VAT组;流式细胞仪检测各组细胞周期、凋亡变化;Real-time PCR、Western blot法分别检测药物刺激前后细胞中AT1R、AT2RmRNA及蛋白表达情况。
　　结果：以1-20μmol/L的梯度递增浓度的VAT处理H9C2细胞24h对心肌细胞生长影响不大。1μmol/L的DOX与不同浓度VAT作用心肌细胞后，细胞存活率上升;其中10μmol/L VAT预处理心肌细胞24h后可明显抑制1μmol/LDOX引起的心肌毒性作用，与对照组相比表现为细胞存活率升高（89.38±4.0）％VS（74.24±3.1）％，与DOX组相比，细胞凋亡率下降(11.10±3.17)％VS(13.15±6.07)％、细胞阻滞在G2/M期为主，同时细胞中AT1R mRNA及AT1R蛋白表达下调，AT2R mRNA及AT2R蛋白表达上调。
　　结论：VAT能抑制DOX诱导的心肌细胞损伤，保护作用可能与其调控血管紧张素Ⅱ受体系统有关。
　　第三部分 AngⅡ受体的抗肿瘤活性
　　目的：探讨缬沙坦通过AT1R/AT2R/RAS/RAF/ERK/B AX/B CL-2信号通路对肿瘤细胞增殖、凋亡的影响。
　　方法：利用CCK-8比色法测定细胞抑制率;流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞周期变化;高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）检测细胞内DOX的药物浓度、Western blot法分别检测药物刺激前后细胞中AT1R、AT2R、RAS、RAF、ERK、BAX、BCL-2的蛋白表达情况。
　　结果：以倍比递增浓度DOX(0.5-40)μmol/L、VAT(1-500)μmol/L分别处理子宫内膜癌细胞(HEC-1A、ISHIKAWA)24h，药物对肿瘤细胞生长的影响呈剂量依懒性，随药物浓度增大，抑制率增高。将相同5μmol/L的DOX与10μmol/L的VAT作用子宫内膜癌细胞后，细胞存活率明显较单独使用DOX组、VAT组下降;其中5μmol/L DOX与10μmol/L VAT同时预处理内膜癌细胞可明显抑制肿瘤细胞生长，与对照组相比表现为细胞存活率下降，当两药联合作用内膜癌后，细胞凋亡率升高，在HEC-1A细胞中凋亡率为（37.82±3.65）％VS（25.72±3.5）％，而ISHIKAWA细胞为(32.74±16.5)％VS（21.18±7.2）％、细胞阻滞在G0/G1期为主，高效液相色谱法检测DOX+VAT组细胞内阿霉素药物浓度高于单独使用DOX组，在HEC-1A细胞中阿霉素浓度为（1.057±0.12）μg/ml VS（0.7935±0.053）μg/ml，而ISHIKAWA细胞为（0.761±0.226）μg/ml VS（0.4335±0.03）μg/ml，细胞中AT1R、RAS、RAF、ERK、BCL-2蛋白表达下调，AT2R、BAX蛋白表达上调。
　　结论：VAT能促进DOX所致肿瘤细胞凋亡，促进作用可能与其调控血管紧张素Ⅱ受体系统有关。

目录

声明

个人简历

摘要

第一章 心肌细胞损伤模型的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 缬沙坦对阿霉素诱导心肌细胞损伤的保护作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 Ang II受体的抗肿瘤活性研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

综述

全文小结

主要英文缩写

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文