高迁移率族蛋白B1调节气道平滑肌细胞表型转换及相关机制的研究

摘要

目的：在哮喘病理生理过程中，气道平滑肌细胞(ASMC)的表型转换是引起气道重塑的重要机制。前期研究发现HMGB1参与支气管哮喘气道重塑过程，在小鼠哮喘动物模型上，拮抗HMGB1活性后降低了小鼠气道ASM厚度，但其机制仍未完全了解。本研究初步探讨HMGB1对大鼠气道平滑肌细胞表型转换的影响及相关机制。 方法：采用原代培养技术培养SD大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)。ASMC用含10％FBS的DMEM培养24小时，换用无血清的DMEM继续培养24小时，使细胞生长同步。1ASMC分为4组：1对照组：仅用2％血清DMEM处理ASMC;2HMGB1100ng/ml组：用HMGB1100ng/ml2％血清DMEM处理ASMC;3HMGB1500ng/ml组：用HMGB1500ng/ml2％血清DMEM处理ASMC;4HMGB11000ng/ml组：用HMGB11000ng/ml2％血清DMEM处理ASMC。各组种在六孔板培养24h后。干预结束，用0.25％胰蛋白酶消化后收集细胞用于检测后续各项指标。2采用划痕实验、transwell检测HMGB1对ASMC的迁移能力的影响。免疫荧光观察不同浓度HMGB1对ASMC骨架重排的影响。流式细胞术检测不同浓度HMGB1ASMC的细胞周期分布影响。Western blot(WB)检测不同浓度HMGB1ASM细胞PCNA、α-smooth muscle actin(α-actin)和SM-22α蛋白表达的影响。3分组：对照组，HMGB11000ng/ml组，HMGB1+抗RAGE组，HMGB1+抗TLR2组、HMGB1+抗TLR4组，收集各组标本后分别WB检测ASMCα-actin和SM-22α表达;免疫荧光观察各组ASMC骨架重排变化。(4)分组：对照组，HMGB11000ng/ml组，HMGB1+LY29400组和LY29400组，收集各组标本后WB检测ASMC的α-actin和SM-22α的表达。免疫荧光观察各组ASMC骨架重排变化。(5)分组：对照组，HMGB11000ng/ml组，HMGB1+抗RAGE组和HMGB1+LY29400组，WB检测各组ASMC AKT磷酸化水平。 结果：1、HMGB1能增强划痕实验、transwell中ASMC的迁移能力，随着HMGB1浓度升高，对ASMC的迁移能力的影响也越强。在荧光显徽镜下观察到：HMGB1可刺激ASMC骨架重排，肌丝增多，细胞多呈板状，呈现出较强张力状态;随着HMGB1浓度升高，作用越强。应用LY294002、抗RAGE受体后，可减弱HMBG1的作用，使肌丝减少。2、流式细胞术结果显示：HMGB1500ng/ml组、HMGB11000ng/ml组的ASMC跃出G1期，进入G2期、S期的细胞比例明显增加，与对照组、HMGB1100ng/ml组相比较，G2期、S期的细胞比例的差异均有统计学意义(P＜0.05)。对照组与HMGB1100ng/ml组相比较，G2期、S期的细胞比例的差异无统计学意义(P＞0.05)。3、HMGB1诱导ASMC的PCNA蛋白表达显著增加(P＜0.05)，且随着浓度的增加蛋白表达增加明显。4、HMGB1诱导ASMC SMA-22α和α-SMA蛋白表达显著减少(P＜0.05)，且随着浓度的增加蛋白表达减少更明显。5、与HMGB11000ng/ml组比较，HMGB1+抗RAGE组ASMC的α-actin和SM-22α表达上调，差异有统计学意义（P＜0.05）;与HMGB11000ng/ml组比较，HMGB1+抗TLR2组和HMGB1+抗TLR4组ASMC的α-actin和SM-22α表达无统计学差异(P＞0.05)。6、与HMGB11000ng/ml组比较，HMGB11000ng/ml+LY294002组的ASMC的α-actin和SM-22α表达上调，差异有统计学意义(P＜0.05);7、与对照组比较，HMGB11000ng/ml组的AKT磷酸化水平明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）;与HMGB11000ng/ml组比较，HMGB1+LY294002组和HMGB1+抗RAGE组ASMC的AKT磷酸化水平降低（P＜0.05）。 结论：HMGB1显著增加ASMC的增殖、迁移能力，促使ASMC骨架重排，调节ASMC表型标志物的表达，从而HMGB1诱导了ASMC表型转换。HMGB1可能通过RAGE、PI3K信号通路诱导ASMC表型转换。以上研究内容有助于对ASM重塑的新机制尤其气道平滑肌表型转换提供新的见解，并有助于为哮喘的气道重塑提供新的治疗靶点。