高迁移率族蛋白B1在调节支气管哮喘气道重塑中的作用及相关机制的研究

摘要

目的:
　　支气管哮喘（简称哮喘）是一种以慢性气道炎症、粘液高分泌和气道高反应性为主要特征的全世界发病率最高的慢性疾病之一，对全球大约3亿患者身体健康造成极大危害。尽管大部分支气管哮喘病人的病情可以得到有效的控制，但是给全球的社会、卫生健康系统和患者本人赋予了极大的经济负担。而尽早的治疗气道重塑被认为是一种潜在的能降低哮喘严重程度、提高哮喘控制和预防改变急性加重的措施，但是目前对于气道重塑的发病机制仍然不是很清楚。研究已经证明炎症因子在促进支气管哮喘的慢性气道炎症和气道结构慢性改变方面扮演重要的角色。
　　高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是一种具有显著促炎效应细胞因子。
　　高迁移率族蛋白B1在细胞核内作为一种绑定在DNA上的非组蛋白，但它有另外一个潜在角色:作为内源性“危险信号分子”，在许多人类疾病中可以启动和扩大固有免疫炎症过程。大量的来源于临床病人和动物模型的研究均支持:当HMGB1被释放到细胞外后可以作为一种重要的促炎症因子。事实上HMGB1在许多临床炎症状态中如脓毒血症、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、慢性肾脏疾病、系统性红斑狼疮等疾病均表达显著升高。最近，我们发现了HMGB1的表达水平在支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者的血浆和诱导痰均异常升高，且HMGB1表达水平与肺功能若干指数呈负相关，而与中性粒细胞计数正相关。
　　我们研究还表明HMGB1在OVA诱导的急性哮喘小鼠动物模型的肺组织和肺泡灌洗液中均表达上调。来自于shim的研究发现HMGB1在嗜酸性气道炎症过程中扮演重要角色。更具吸引力研究的是HMGB1还被发现在肺纤维化过程中非常重要，HMGB1参与这一过程部分是通过降低肺成纤维细胞增殖和下调肺泡灌洗液中的白介素1-β来实现。此外一些研究表明HMGB1可以增加血管内皮生长因子的分泌，而动物模型上，使用HMGB1抗体拮抗HMGB1活性可以抑制基质金属蛋白酶-9活性;而这两种因子在气道重塑-这一支气管哮喘重要病理生理过程中扮演重要作用。
　　基于以上资料和实验，我们假设释放到气道中HMGB1在慢性气道小鼠模型的气道重塑过程中扮演重要角色。为了验证这个假设，我们检测了HMGB1在小鼠肺组织和肺泡灌洗液中的含量，接下来我们通过检测呼吸动力学、卵清白蛋白-特异性的Ig E，胶原沉积、气道平滑肌厚度、上皮粘液分泌和炎症介质变化观察HMGB1对慢性哮喘小鼠模型气道重塑的影响。此外我们在体外还观察了HMGB1对人胎肺成纤维细胞的增殖、迁移和胶原合成是否有直接影响，以此阐明部分可能机制。最后我们还研究了HMGB1和HMGB1/IL-1β复合物对于转化生长因子β1，血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶-9分泌表达影响，帮助明确这些因子的细胞来源。
　　方法:
　　一、动物实验
　　1.雌性Balb/c小鼠（每组8只）被随机分成磷酸盐(PBS)对照组，卵清蛋白蛋白组(OVA)，OVA+同种异型抗体，OVA+抗HMGB1抗体组。小鼠通过OVA-氢氧化铝凝胶腹腔注射致敏，继而用OVA滴鼻反复激发6周制作慢性支气管哮喘模型。抗HMGB1中和抗体在激发前使用。
　　2.气道高反应性在最后一次激发24小时进行，使用乙酰胆碱为激发剂，通过体积描记法和有创方法两种方法测量气道高反应性。
　　3.肺泡灌洗液和肺组织的收集
　　在最后一次激发后48小时处死小鼠，PBS灌洗后收集肺泡灌洗液。HE染色法分类计数肺泡灌洗液中细胞。酶联免疫吸附测定法检测肺泡灌洗液中细胞因子含量。右上肺冻存后用于测定胶原含量，右肺下叶用于做蛋白免疫印迹(WB)。左肺固定后石蜡包被后行HE染色、免疫组化、马松三色染色、过碘酸-雪夫染色。
　　4.胶原含量检测
　　根据胶原蛋白检测试剂（Sirius Red Collagen Detection Kit）说明书检测胶原含量，结果用胶原微克/克肺表示。
　　5.免疫组化
　　左肺固定后用HE染色评估肺组织病理改变，然后分别用α-SMA和HMGB1抗体检测上述两种蛋白在肺组织中的表达。
　　二、体外细胞实验
　　1.HMGB1对人胎肺成纤维细胞MRC-5的体外影响
　　人胎肺成纤维细胞MRC-5在培养基DMEM中培养
　　1.1 成纤维细胞迁移实验迁移实验采用“画痕实验”进行比较
　　1.2 成纤维细胞增殖实验以DMEM为培养基，在12孔板每孔种入5*104胎肺成纤维细胞，使用不同浓度的HMGB1刺激MRC-5细胞1天，2天，3天后，分别用胰蛋白酶消化后计数每孔细胞数量。
　　1.3 采用荧光定量PCR和蛋白印记法分别检测α-SMA的表达
　　2.探讨HMGB1和HMGB1/IL-1β复合物引起那些细胞的分泌表达转化生长因子-β1，血管内皮生长因子，基质金属蛋白酶-9
　　2.1 原代培养人支气管上皮细胞
　　原代培养的支气管上皮细胞种植于12孔板中，每孔2×105细胞，然后这些细胞接受HMGB1和HMGB1/IL-1β复合物刺激24小时。
　　2.2 细胞系的培养和分化
　　细胞系A549，16-HBE，U937和THP-1均在RPMI-1640培养基中培养。1×106/毫升的THP-1和U937细胞分别接受佛波酯(PMA)刺激48小时和72小时，使得上述细胞分化成单核/巨噬细胞亚型。每次实验时，2×105个上皮细胞和1×106个U937和THP-1细胞种植于12孔板中，分别接受HMGB1，IL-1和HMGB1/IL-1β复合物的刺激。上述细胞刺激24小时候，收集细胞上清、总RNA、细胞裂解液行进一步实验检测。
　　2.3 嗜酸性粒细胞的分离和培养
　　采用负性免疫磁珠分离法分离外周血中嗜酸性粒细胞，采用HE染色检测分离嗜酸性粒细胞纯度，至少大于95％，分离成功后，嗜酸性粒细胞按照每孔5×105个细胞种植于24孔板中，然后接受HMGB1和HMGB1/IL-1β复合物刺激24小时。
　　统计学分析：
　　结果用平均数±标准误表示，数据采用单因素方差分析或者两分类方差分析分析，组间差异采用Bonferroni法比较， P值＜0.05被认为有统计学差异。
　　结果：
　　1.HMGB1在慢性哮喘小鼠模型中表达上调
　　OVA诱导的哮喘小鼠肺组织和肺泡灌洗液中HMGB1表达均升高，免疫组化提示HMGB1主要在小鼠肺泡巨噬细胞和上皮细胞表达，而HMGB1表达阳性细胞在该模型中显著增加。
　　2.拮抗HMGB1对OVA诱导的慢性哮喘小鼠模型气道重塑影响
　　与慢性哮喘组小鼠比较，拮抗HMGB1组的小鼠的肺泡总细胞数和嗜酸性粒细胞数明显下降;OVA哮喘组的气道高反应性明显增加，而拮抗HMGB1活性后导致小鼠气道高反应性的下降。
　　与OVA诱导慢性哮喘组小鼠比较，接受抗HMGB1抗体注射组小鼠的气道血管周围区域的胶原沉积、PAS-阳性细胞数、气道周围平滑肌厚度均显著下降。
　　类似的，拮抗HMGB1均下降了小鼠外周血OVA-特异性IgE水平和肺泡灌洗液中的IL-1β，IL-4，IL-5，IL-13，TNF-α，VEGF，活性-TGF-β1和总MMP-9表达水平，免疫蛋白印记法进一步证明了:与慢性哮喘组小鼠比较，拮抗HMGB1组小鼠的肺组织的VEGF，总-TGF-β1和MMP-9的蛋白表达下降。另外，通过明胶酶谱法证实，与慢性哮喘组小鼠比较，拮抗HMGB1组小鼠的肺泡灌洗液中MMP-9的活性下降。
　　3.体外HMGB1对MRC-5细胞影响
　　浓度为250和1000 ng/mlHMGB1能够浓度依赖性的增加MRC-5细胞的迁移能力。另外浓度为250和1000ng/mlHMGB1能够显著增加MRC-5细胞的生长。以1000 ng/mlHMGB1作时间依赖性实验发现，这种促增殖效应在第2天最明显。另外，浓度为250和1000ng/mlHMGB1能够增加MRC-5细胞的α-SMA mRNA的表达和蛋白表达。而1000 ng/mlHMGB1能够提高该细胞胶原分泌2-3倍。
　　4.HMGB1轻度增加TGF-β1的分泌
　　HMGB1和IL-1β作用于嗜酸性粒细胞24小时，仅少量增加该细胞分泌TGF-β1，在其他细胞上没有发现HMGB1和IL-1β能够增加TGF-β1的分泌。
　　5.HMGB1增加MMP-9表达和活性
　　0.5 ng/ml IL-1β和250ng/mlHMGB1复合物以及2 ng/ml IL-1β与1000ng/ml HMGB1复合物能够显著增加16-HBE细胞，PBECs，A549 cells和中性粒细胞的MMP-9细胞的分泌。
　　6.HMGB1增加VEGF的表达和分泌
　　HMGB1/IL-1β复合物可以增加16-HBE细胞，原代培养支气管上皮细胞，A549细胞，未分化U937 cells，分化和未分化的THP-1细胞和肺泡巨噬细胞的VEGF的分泌和表达。
　　结论：
　　抑制HMGB1可以抑制支气管哮喘气道重塑过程，这一效应可能与抑制气道炎症和调节肺成纤维细胞的激活和表型有关。

目录

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个人简历

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摘要

前言

参考文献

第一部分 拮抗高迁移率族蛋白B1(HMGB1)活性对慢性哮喘小鼠气道重塑的影响

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

参考文献

第二部分 高迁移率组蛋白B1(HMGB1)对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)增殖、迁移、表型等影响

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

参考文献

第三部分 高迁移率组蛋白B1(HMGB1)对TGF-β1，MMP-9，VEGF表达和分泌影响

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

参考文献

全文小结

综述 正高迁移率组蛋白B1(HMGB1)与支气管哮喘研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表论文