肿瘤相关巨噬细胞过表达巯基氧化酶1对人SMMC-7721肝癌细胞功能影响的研究

摘要

目的:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是中国常见的恶性肿瘤之一，病死率高，研究肝癌相关的发病机制可以帮助提高临床诊疗效果，并能提升患者的生活质量。肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)这个概念的提出为研究肿瘤的发病机制提供了新思路，近几年已成为了癌症研究的热点。本课题拟通过检测SMMC-7721肝癌细胞的细胞功能上的改变，明确巯基氧化酶1(Sulfhydryl oxidase1，QSOX1)过表达对肝癌细胞功能的影响，探索肝癌微环境通过外分泌蛋白影响肝癌转移、复发的具体机制。
　　方法:通过载有QSOX1过表达基因的慢病毒感染人急性单核白血病细胞THP-1，筛选出稳定过表达QSOX1的THP-1细胞，将其作为过表达组（OE组）;同时，将空病毒转染的THP-1细胞作为阴性对照组（NC组）和未做任何处理的THP-1细胞作为空白对照组（BC组）。使用佛波酯（Phorbol12-myristate13-acetate，PMA）将THP-1细胞诱导成未分化巨噬细胞(undifferentiated macrophage，UM0)，用无血清培养基培养UM0后，收集UM0的培养液，去除细胞后即为条件培养液。实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative-polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)分别检测QSOX1的RNA相对表达量和蛋白表达量。用三组巨噬细胞的条件培养液分别培养SMMC-7721肝癌细胞后，CCK-8增殖实验检测肝癌细胞增殖能力的改变，克隆形成实验检测肝癌细胞的克隆形成能力，Transwell小室实验检测肝癌细胞的侵袭和转移能力，划痕实验检测条件培养基中的QSOX1对SMMC-7721肝癌细胞迁移功能的影响。用SPSS21.0进行统计数据的分析。
　　结果:RT-PCR结果显示QSOX1过表达基因成功在THP-1细胞中表达;WB检测发现QSOX1有QSOX1-S和QSOX1-L两种蛋白亚型，且OE组蛋白表达量明显高于阴性对照组和空白对照组。通过PMA成功将THP-1细胞诱导成巨噬细胞UM0。克隆形成实验发现，OE组肝癌细胞形成的克隆数平均为82.67±9.07个，高于BC组的48.33±7.50个和NC组的44.67±9.29个，差异有统计学意义(P＜0.05);细胞增殖实验显示，QSOX1过表达组肝癌细胞增殖能力在72h时间点开始高于其他两组(P＜0.05)，可促进肝癌细胞增殖;细胞划痕实验表明，OE组在12h和24h肝癌细胞的迁移面积均值分别为0.613±0.076mm2和1.477±0.160mm2，均明显高于其他两组在此时间点的迁移面积，差异有统计学意义(P＜0.05);Transwell转移实验中，OE组平均细胞转移数为157±16.66个，BC组为105±14.68个，NC组为116±11.98个，过表达组细胞转移数明显高于其它两组，差异有统计学意义(P＜0.001);Transwell侵袭实验，三组肝癌细胞的细胞侵袭数并未出现明显差别(P＞0.05)。
　　结论:肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞UM0可通过PMA诱导THP-1细胞获得。QSOX1蛋白有两种亚型，分别为QSOX1-S(67Kd)和QSOX1-L(83Kd)。QSOX1蛋白过表达可增加SMMC-7721肝癌细胞的增殖和迁移能力，QSOX1对肝癌的发生发展有调控作用，同时，本实验也为研究分泌蛋白质组在肝癌中所起的作用提供了实验依据。

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