IL--33/ST2在人芽囊原虫感染大鼠模型中的表达研究

摘要

目的： 通过对人芽囊原虫（Blastocystis hominis,B.hominis）感染大鼠的方式进行改良，建立稳定的B.hominis感染大鼠模型。比较不同感染时间大鼠的免疫病理变化，观察感染大鼠肠组织的病理变化及其超微结构变化，检测IL-33/ST2及相关因子在B.hominis感染大鼠中的表达，并探讨其可能的调控途径，为人芽囊原虫病的诊断和治疗提供新的思路。 方法： 第一部分：B.hominis感染SD大鼠方式的改良 采用洛氏液-鸡蛋-血清(Lock's-Egg-Serum，LES)培养基进行虫体培养繁殖，将30只雄性SD大鼠随机分为5组，1个对照组和4个感染组，每组6只，感染组大鼠分别灌食感染105、106、107和108/个B.hominis滋养体，对照组大鼠灌食等体积PBS。于感染后第3天开始收集大鼠粪便，置于LES培养基培养72h后观察B.hominis虫体，每隔3天收集一次粪便进行体外培养，连续培养观察5次，记录每组大鼠的感染情况。于感染后第21天以颈椎脱臼法处死大鼠，分别取十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠组织备用，同时取各肠段内容物进行体外培养并进行虫体计数。提取感染前后的虫体DNA，经PCR和基因测序比较感染前后虫株的基因型，通过HE染色法观察各肠道组织病理损伤。 第二部分：IL-33/ST2及相关因子在B.hominis感染中的表达研究 1.感染模型的建立及取材：30只雄性SD大鼠随机分为1个对照组和4个感染组，每组6只，感染组分别为感染1周组、3周组、9周组和24周组，感染组大鼠灌食感染108/个B.hominis滋养体，对照组大鼠灌食等体积PBS，分别于感染后第1周、第3周、第9周和第24周以心脏穿刺法收集血液，颈椎脱臼法处死大鼠，分别取回肠、盲肠和结肠组织备用。 2.感染大鼠免疫病理观察：通过HE染色法观察回肠、盲肠和结肠组织的病理损伤;通过透射电镜观察盲肠的超微结构损伤;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测盲肠中IL-33及其跨膜受体ST2L(trans-membrane receptor)、可溶性受体sST2(soluble decoy receptor)、以及IL-2、TGF-β、Foxp3、IL-10、IL-4和IL-6mRNA的表达水平;采用ELISA检测大鼠血清中总IgG的表达水平。 结果： 第一部分：B.hominis感染SD大鼠方式的改良 105、106、107和108感染组中最终确定感染B.hominis的大鼠数目分别为2只、3只、5只和6只。105感染组于第6天开始出现阳性鼠2只，持续到第21天;106感染组阳性鼠的数目存在一定波动，各时间点检出的阳性鼠数在1-4只不等;107感染组除了第6天时发现阳性鼠6只，其余时间查出结果均为5只，比较稳定;108感染组除了第3天时为5只，其余时间均发现阳性鼠6只，感染状态最为稳定;对照组在各时间点均未检出虫体。PCR及序列比对证实感染后大鼠分离的虫株与感染所用虫株均为ST7同型。肠道内容物体外培养结果显示，回肠、盲肠和结肠的内容物均成功培养出B.hominis，且盲肠与结肠内容物培养出的虫数呈正相关(p＜0.05)。HE染色结果显示在盲肠发现B.hominis寄生和黏蛋白存在，其余部位未发现B.hominis寄生。 第二部分：IL-33/ST2及相关因子在B.hominis感染中的表达研究 1.肠道病理变化：HE染色结果显示回肠组织结构完整，肠绒毛排列规则，未发生明显病理变化;而在盲肠与结肠中均有B.hominis虫体侵入上皮组织，在结肠中甚至发现已有虫体侵入固有层。对盲肠组织进行透射电镜观察发现，B.hominis感染大鼠的微绒毛严重脱落且排列稀疏，细胞间的紧密连接融合，边界模糊，细胞核发生皱缩。 2.采用RT-qPCR对B.hominis感染大鼠盲肠中IL-33、ST2L、sST2、IL-2、TGF-β、Foxp3、IL-10、IL-4和IL-6mRNA的表达水平进行检测，结果显示在感染第1周和第9周时，与对照组相比，各细胞因子的表达水平有显著变化(p＜0.01)：IL-33与ST2L的表达水平显著上调，与该信号通路相关的因子IL-2的表达量较对照组也显著上调(p＜0.01);IL-33的可溶性受体sST2对IL33/ST2信号通路有负反馈调节的作用，我们的结果显示，在感染第3周和第9周时，sST2的mRNA表达水平较对照组显著升高(p＜0.05)。IL-33/ST2信号通路的激活，可促进Treg细胞的活化，我们发现与之相关的TGF-β于B.hominis感染后第1周表达量较对照组显著上调(p＜0.01)，之后逐渐下降，于第9周时表达量显著低于对照组(p＜0.05)，而Treg细胞标志物Foxp3(p＜0.01)、抑炎因子IL-10和IL-4(p＜0.05)的表达水平在感染第1周显著升高，同时促炎因子IL-6表达水平亦显著高于对照组(p＜0.01)。在感染第3周时IL-2和IL-4mRNA的表达量较对照组显著下调(p＜0.01)，TGF-β和Foxp3mRNA的表达量较对照组显著上调(p＜0.01)，其余各因子较对照组表达无差异(p＞0.05)。在感染第24周时各因子的表达量都趋于正常，与对照组无差异(p＞0.05)。以上结果提不，IL-33/ST2信号通路的激活，有促进Treg细胞的活化，分泌IL-10等因子发挥抑炎效应的作用。 3.免疫球蛋白变化：ELISA结果显示不同时间点总IgG的表达水平有差异(p＜0.01)，采用LSD检验进行两两比较显示感染后第3周与24周都较对照组显著上调(p＜0.01)。 结论： 1.采用B.hominis滋养体可成功建立大鼠感染模型。灌食105个B.hominis滋养体即可成功感染大鼠，108个B.hominis滋养体的感染效果稳定。B.hominis感染大鼠后可于盲肠粘膜层和结肠固有层中发现入侵的虫体，提示盲肠和结肠可能是B.hominis定居和致病的部位;大鼠盲肠上皮细胞超微结构改变提示，B.hominis感染可导致大鼠肠上皮细胞损伤。 2.B.hominis感染大鼠后IL-33/ST2及相关因子表达上调，提示机体可能通过激活IL-33/ST2信号通路诱导IL-2的产生，在TGF-β协同作用下引起Foxp3表达上调，激活Treg细胞从而增加IL-10的分泌来参与免疫调节。 3.B.hominis感染大鼠后IL-33/ST2及IL-4、IL-6和总血清IgG抗体表达上调，提示机体还可能通过激活IL-33/ST2信号通路促进Th2型细胞因子表达，从而诱导体液免疫应答。