人芽囊原虫纯培养的建立及SD大鼠感染模型Th1/Th2细胞因子表达变化的研究

摘要

目的:探讨碘染色法与改良培养法在人芽囊原虫(B.h)检出中的应用，并以此获得虫株后建立B.h纯培养体系，进而采用纯培养虫株建立SD大鼠感染模型，动态研究B.h感染大鼠的Th1/Th2平衡调节。
　　方法:比较普通培养法和改良培养法的最低检出限、生长曲线及厌氧环境形成时间;从广西医科大学附属肿瘤医院门诊检验科收取397份粪便样本，采用碘染色法和改良培养法对样本进行检测，对阳性标本采用碘染色法和三色染色法进行染色观察，比较阳性检出率，以改良培养法为金标准，计算碘染色法的灵敏度、特异度、一致率和kappa值，采用PCR方法进行基因分型;采用LES培养基进行带菌培养，联合使用青霉素(1000U/ml)、链霉素（1000ug/ml）、两性霉素B(2.5 ug/ml)、磷霉素（20ug/ml）、阿莫西林-克拉维酸钾混悬液（31.25ug/ml）、氯霉素（20ug/ml）等6种抗生素进行无菌纯培养，使用鸡蛋上清液-马血清-Bacto agar混合琼脂平板，进行单克隆试验;获取纯培养虫株后，取30只SD大鼠，分5组，每组6只，经地塞米松免疫抑制后，实验组经口感染107/只，对照组经口灌食等量灭菌PBS，分别于0d、3d、6d、9d和14d处死大鼠取材，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-10的表达水平，比色法检测结肠组织中髓过氧化物酶(MPO)的含量，HE染色观察结肠组织病理损伤，荧光定量PCR检测结肠中IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-10 mRNA的表达水平。
　　结果:改良培养法的最低检出限低于普通培养法，改良培养法在B.h的密度在前3天高于普通培养法;在粪便及短期培养的标本中，可观察到空泡型和颗粒型，在粪便标本中可以观察到包囊;碘染色法的阳性率为1.01％，改良培养法的阳性率为5.54％，两者的阳性率差别有统计学意义;以改良培养法结果为金标准，碘染色法的灵敏度为18.18％，特异度为100％，一致率为95.47％，kappa值为29.57％;带菌培养和纯培养的B.h均以空泡型为主，带菌培养和纯培养的密度到达峰值的时间基本相同，但是带菌培养的密度下降很快，纯培养的密度下降缓慢，维持较高的密度;在鸡蛋上清液-马血清-Bacto agar混合琼脂平板表面可观察到“菌落状”白色圆点，倒置显微镜下可看到大量空泡型虫体;感染大鼠与对照组的结肠病理评分为0分，感染大鼠结肠的MPO含量与对照组相比无显著改变;感染大鼠血清中IFN-γ和IL-4的表达水平与对照组相比无显著改变，14d组大鼠血清中TNF-α与对照组相比较有显著改变，3d组(P=0.003)、6d组(P=0.013)、9d组(P=0.004)、14d组(P=0.000)大鼠血清中的IL-10与对照组相比较均有统计学意义;各组结肠中细胞因子IFN-γ mRNA表达比较具有统计学差异，其中3d组、6d组和14d组与对照组相比较均具有统计学意义;各组大鼠结肠中的TNF-αmRNA比较具有统计学意义，但组间两两比较均无统计学意义;各组结肠中细胞因子IL-4 mRNA表达比较具有统计学差异，其中6d组和9d组与对照组相比较均有显著改变;各组大鼠结肠中的IL-10 mRNA比较具有统计学意义，其中6d组与对照组相比较有显著改变。
　　结论:改良培养法的灵敏度高于碘染色法，可用于B.h的实验室诊断;联合大剂量使用抗生素可以获得纯培养的虫株并用固体培养基实现B.h的单克隆，且体外纯培养的B.h虫株可成功感染SD大鼠;ST3型B.h感染可影响大鼠Th1/Th2的平衡调节。

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个人简历

摘要

第一章 碘染色法与改良培养法在人芽囊原虫诊断应用中的比较

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第二章 人芽囊原虫体外纯培养的建立

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第三章 Th1／Th2细胞因子在人芽囊原虫感染SD大鼠动物模型中的表达研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

结论

综述 人芽囊原虫致病性的研究进展

中英文缩略词

致谢

攻读学位期间发表的论文