hOGG1基因rs1052133风险位点与鼻咽癌预后相关性及其潜在机制研究

摘要

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种区域性高发的头颈部恶性肿瘤，常见于我国广东和广西等南方地区。目前同步放化疗仍是鼻咽癌的主要治疗手段。化学疗法是全身治疗，目前的给药剂量仍以体表面积为基础进行计算，由于无法估计个体的药物敏感性，使得临床治疗效果上常出现毒副反应过大或治疗效果不佳等两种现象。随着药物遗传学的发展，基因指导下的个体化治疗成为提高癌症治疗效果、减少无效治疗的有效途径。预测存在疗效差异的相关性遗传标志物，如单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)可以预测患者的治疗疗效及不良反应，为癌症的个体化治疗提供依据，从而指导临床治疗并提高疗效。研究发现，多种肿瘤在临床治疗中对药物的敏感性可能与其细胞DNA氧化损伤修复能力不同有关。DNA修复存在多种途径，其中碱基切除修复(base excision repair，BER)途径中人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(human8-oxoguanine DNA glycosylase1，hOGG1)可能起到了重要作用。本课题组前期通过对来自广西地区鼻咽癌患者和健康对照组人群外周血样本进行单碱基切除修复通路基因的序列多态性筛查时发现，功能性位点hOGG1rs1052133GG基因型在两组人群中存在明显差异。这两种基因型是否存在功能差异是本次研究的目的。 目的：评估hOGG1rs1052133不同基因型与鼻咽癌患者预后的相关性，同时建立hOGG1不同基因型过表达细胞株并对rs1052133SNP GG/CC位点功能进行探索，综合分析其损伤修复差异及与临床预后相关的作用机制。 方法：1.利用本课题组前期研究中接受了hOGG1rs1052133SNP分型测定的鼻咽癌病人作为预后分析的候选对象进行hOGG1rs1052133SNP与鼻咽癌患者预后相关性分析。2.构建hOGG1rs1052133位点不同基因型过表达载体，进行慢病毒包装，感染并建立稳定过表达的细胞株，利用荧光显微镜、RT-qPCR及WB检测细胞株目的基因感染效率，测序鉴定目的基因。3.利用MTT法、活细胞工作站实时观测、流式细胞术、RT-qPCR、WB、免疫荧光技术等对hOGG1rs1052133SNP进行功能分析，同时利用免疫共沉淀及质谱法探索与hOGG1相互作用的蛋白。 结果：1.hOGG1rs1052133GG/CC与鼻咽癌预后相关性：选取本课题组前期研究中接受了hOGG1rs1052133多态性分型的488例鼻咽癌患者，对所有病人资料进行分析，筛选剔除不符合标准的病例，其中352例符合并被纳入后续的随访分析。352例鼻咽癌患者hOGG1rs1052133SNP与OS(overall survival)的单因素分析：CC基因型(p=0.018)、T分期(p=0.020)与OS显著相关。352例鼻咽癌患者TFS(tumor-free survival)的单因素分析：T分期(p=0.009)与TFS显著相关，而CC基因型(p=0.066)与TFS有显著相关的趋势。多因素分析结果显示，CC基因型(HR2.133，95％CI1.217-3.738)，T分期(HR2.113，95％CI1.021-4.374)是OS的独立预后影响因子。对于TFS的多因素分析中，CC基因型(HR1.789，95％CI1.046-3.057)，T分期(HR2.105，95％CI1.090-4.066)是其独立预后影响因子。我们还对323例晚期鼻咽癌患者(Ⅲ+Ⅳ期)进行分析：CC基因型(p=0.008)、T分期(p=0.049)与OS显著相关。CC基因型(p=0.039)、T分期(p=0.031)与TFS显著相关。多因素分析结果显示，CC基因型(HR2.158，95％CI1.236-3.768)，T分期(HR2.236，95％CI1.107-4.514)是OS下降的独立预后影响因子。CC基因型(HR1.783，95％CI1.050-3.028)，T分期(HR2.043，95％CI1.077-3.875)是TFS下降的独立预后影响因子。 2.成功构建hOGG1rs1052133GG/CC过表达载体的慢病毒感染细胞株：(1)细胞形态观察显示，各组细胞间形态结构无明显差异;荧光视野与明场视野叠加对比后发现，各组细胞均带有荧光，显示出极高的目的基因效率。(2)稳定转染后的HK1细胞中hOGG1-GG-HK1和hOGG1-CC-HK1mRNA表达水平约是空载N-HK1的2.3倍左右。(3)wB结果显示hOGG1-GG-HK1和hOGG1-CC-HK1hOGG1蛋白表达量均略高于N-HK1细胞。(4)测序结果显示hOGG1-GG-HK1和hOGG1-CC-HK1两个目的序列仅在rs1052133突变位点存在GG/CC变异外，其余序列均不变。 3.hOGG1rs1052133SNP GG/CC位点功能探索：(1)MTT结果显示，三组细胞无应急压力条件下的生长速率无明显差异。在药物作用下，两个实验组应激损伤修复能力均优于空载对照组N-HK1，其中hOGG1-CC-HK1细胞的药物抵抗能力要强于hOGG1-GG-HK1细胞，在低浓度药物作用下更为明显。(2)活细胞工作站实时观察小剂量DDP药物作用对细胞增殖影响结果显示，hOGG1-CC-HK1细胞在药物作用下表现出了更高的增殖能力，hOGG1-GG-HK1细胞次之，N-HK1细胞受到了最大生长抑制。(3)流式细胞术检测药物作用细胞周期的影响，结果N-HK1细胞G2/S期受到的阻滞最明显，对GG型细胞的阻滞效果次之，而对CC型细胞的影响最小。(4)在药物作用前后的hOGG1mRNA水平检测结果显示，hOGG1mRNA在进行药物处理后呈小剂量依赖性上调，其中hOGG1-CC-HK1细胞的上调最为明显。(5)免疫荧光结果显示，药物处理后hOGG1-CC-HK1细胞中hOGG1表达最高。(6)WB结果显示，hOGG1-CC-HK1细胞的hOGG1蛋白水平随药物作用浓度出现剂量依赖性上调。而hOGG1-GG-HK1细胞的hOGG1蛋白水平随药物作用浓度呈剂量依赖性略有下调。(7)在未处理的情况下，hOGG1-GG-HK1细胞中DUSP6表达量最高。在药物作用后，上调hOGG1表达的两实验组细胞处理后DUSP6均呈现不同程度的下调，hOGG1-CC-HK1细胞尤为明显，但当药物浓度增加到一定程度时，DUSP6又会出现上调。(8)免疫共沉淀结果显示hOGG1和DUSP6并非直接互作。 结论：1.hOGG1rs1052133CC基因型可能是预测鼻咽癌预后的独立危险因素。 2.成功构建了稳定转染hOGG1rs1052133SNP的hOGG1-GG-HK1和hOGG1-CC-HK1鼻咽癌细胞模型。 3.hOGG1rs1052133CC基因型的损伤修复功能强于hOGG1rs1052133GG基因型。 4.hOGG1rs1052133CC基因型在鼻咽癌细胞中抑制DUSP6表达的作用比hOGG1rs1052133GG基因型明显。 5.hOGG1和DUSP6并非直接结合来发挥功能，具体作用途径仍有待于进一步研究。 6.hOGG1rs1052133CC基因型的NPC患者是否需要提高药物治疗浓度以增加治疗效果、改善预后，有待于进一步确定。