野油菜黄单胞菌gum基因簇DNA片段上基因间隔区中的ORF及其功能分析

摘要

利用RT-PCR的方法,对野油菜黄单胞菌致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)8004(Xcc8004)及其Tn5gusA5转座子插入gum基因的突变体的gum基因操纵子的转录进行了比较分析.结果表明Tn5gusA5的插入具有很强的完全极性效应,并进一步证实gumK,gumL和gumM基因构成了gum基因操纵子中第二个转录本.通过TAIL-PCR和测序方法对转座子Tn5gusA5插入突变体TGL243,TGL14,TGL233和TGL40中转座子Tn5gusA5在Xcc8004基因组中的位置进行了定位.并对这四株突变体的一些生物学特性和流变学特性进行了测定和分析,结果表明突变体TGL243色素产量约为Xcc8004色素产量的34％,TGL40约为Xcc8004的130%.TGL233胞外多糖的组分和粘度与Xcc8004不同,其胞外多糖的粘度为Xcc8004的63%.用RT-PCR的方法对gum基因族gumA-gumB区段进行了转录分析,认为gumA-gumB基因区段具有两个可转录的区段ORF243和ORF233.为了进一步验证ORF243与色素有关,ORF233与胞外多糖的组分和粘度有关,我们成功的构建了这两个ORF的整合突变体TGL243＃和TGL233＃.结果表明整合突变TGL243＃与插入突变体TGL243的的色素产量相一致,约为Xcc8004色素产量的34%.通过ncbi中的blast搜索,结果表明ORF243编码产物为一种转录调控蛋白,推测ORF243可能与色素的合成有关,而ORF233在ncbi中没有找到与之同源的基因编码产物.整合突变体TGL233＃与插入突变体TGL233胞外多糖粘度相一致比Xcc8004低,约为Xcc8004的63%,推测ORF233与胞外多糖的粘度和组分有关.

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

1.1野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)的概述

1.2胞外多糖(EPS)

1.3胞外多糖(EPS)与致病性的关系

1.4 Xcc胞外多糖(EPS)的分子结构

1.5胞外多糖(EPS)的生物合成及调控

1.6胞外多糖的粘度

1.7黄单胞菌色素

1.8 Tn5gusA5转座子

1.9本研究工作的目的、内容及意义

1.9.1研究内容

1.9.2目的意义

第二章材料与方法

2.1培养基及培养条件

2.2.1培养基

2.2.2培养条件

2.3抗菌素

2.4溶液，缓冲液和试剂

2.5总DNA的提取

2.6 DNA质粒的提取

2.7限制性内切酶酶切

2.8 DNA连接

2.9转化

2.10三亲本接合

2.11 RNA操作

2.11.1试验器具的处理

2.11.2溶液处理

2.11.3操作过程注意事项

2.11.4 Xcc细胞总RNA的提取

2.11.5 RNA中DNA的去除

2.11.6直接从细胞中少量快速提取总DNA

2.11.7 RNA浓度及纯度的测定

2.11.8 RNA快速电泳检测

2.12 PCR反应

2.12.1 TAIL-PCR用于扩增Tn5 gusA5旁测序列

2.12.2 RT-PCR反应

2.12.3整合突变体引物

2.12.4常规反应PCR反应

2.12.4重复

2.13琼脂糖凝胶电泳

2.14 DNA的回收

2.14.1电洗脱法回收DNA片段

2.14.2 PCR扩增产物回收

2.15 ABI DNA自动测序系统测定DNA序列

2.16胞外多糖的分离与提纯

2.17胞外多糖纯度鉴定采用凝胶过滤法

2.18胞外多糖理化特性测定

2.18.1胞外多糖的特性粘度测定

2.18.2胞外多糖的组分测定

2.19胞外酶的平板定性检测

2.19.1胞外蛋白酶的检测

2.19.2胞外纤维素酶的检测

2.19.3胞外淀粉酶的检测

2.20色素的测定

2.21 DSF因子检测

第三章 结果与分析

3.1 Tn5gusA5转座子的极性效应

3.1.1 Xcc8004及其gum基因突变体的总RNA

3.1.2 RT-PCR扩增的gum基因簇中的gum基因的DNA片段

3.1.3单一gum基因的Tn5gusA5插入位点前后的RT-PCR扩增的DNA片断

第四章讨论

第五章 结果与分析

5.1 Tn5gusA5突变体在Xcc8004基因组上插入的定位

5.1.1通过TAIL-PCR扩增Tn5gusA5旁侧序列：

5.1.2 Tn5gusA5旁侧序列的测定

5.2插入突变体的GUS的活性

5.3营养缺陷型鉴定

5.4插入突变体的DSF

5.5插入突变体的胞外酶产量

5.6插入突变体的胞外多糖产量

5.7插入突变体和Xcc8004的色素产量

5.8黄原胶的粘度

5.9胞外多糖的组份

5.9.1测定结果

5.9.2测定计算结果：

5.10 gumA-gumB间隔区的转录区段

5.1 0.1 Tn5gusA5插入突变体及Xcc8004的总RNA

5.10.2 Tn5gusA5插入突变体TGL243转录区段的RT-PCR

5.1 0.3 Tn5gusA5插入突变体TGL243位点前后的RT-PCR

5.10.4 Tn5gusA5插入突变体TGL233转录区段的RT-PCR

5.10.5 Tn5gusA5插入突变体TGL233位点前后的RT-PCR

5.11 ORF243和ORF233与gum操纵子

5.12 ORF243和ORF233的整合突变体

5.12.1 ORF243和ORF233的内嵌DNA

5.12.2重组质粒的酶切

5.12.3三亲本接合

5.12.4标准PCR验证整合突变体

5.13整合突变体的色素

5.14整合突变体胞外多糖的粘度

第六章讨论

参考文献

致谢