PCR-DGGE技术在水牛瘤胃产甲烷古菌探索中的应用

摘要

反刍动物瘤胃温度恒定而且高度厌氧，是一个非常复杂的活体环境。这里生活着细菌，真菌，原虫等，然而至今80％以上生活在瘤胃内的微生物都不可培养，即便是可以得到纯培养的瘤胃微生物也只能通过表观的一些理化性质的鉴定加以认识。近年来，基于16SrRNA的分子生物学的方法为揭示微生物菌群多样性提供了更有力的帮助。
　　 本文通过使用PCR-DGGE技术对广西本地沼泽型水牛瘤胃产甲烷古菌进行探索，具体结果如下：
　　 1、采集广西本地沼泽型水牛瘤胃内容物，过滤处理后将样品分别经反复冻溶、液氮研磨和超声波三种方法破碎细胞,然后加入含有蛋白酶K的消化液恒温消化，将消化后的样品经经典的酚/氯仿法提取DNA。检验DNA浓度和纯度，进行琼脂糖电泳，并做PCR验证。结果表明，反复冻溶法提取水牛瘤胃微生物总DNA效果最好。
　　 2、采用ARC344f-GC/519r,ARCH915-GC/UNI-b-rev,PARCH519f/ARC915r-GC，ARC344f-GC/ARC915r四对带有“GC夹板”的产甲烷古菌通用引物扩增水牛瘤胃产甲烷古菌高变区16SrRNA基因序列。因引物的不同选择合适的PCR体系和程序进行扩增，并进行琼脂糖电泳检测。结果表明，3、选用引物ARCH519f/ARC915r-GC扩增的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)。由DGGE电泳图谱条带分散情况，可以看到菌群呈现多样性。由聚类树图，可以看到样品个体间存在差异。将9条克隆所得基因序列放入GenBank中进行BLAST作同源性比对，建立进化树，比较不同序列之间的亲缘关系。结果表明，所得序列中有3条与甲烷短杆菌同源性高达99％，1条与甲烷短杆菌同源性达98％，1条属于不明古菌和热原体目同源性达98％。另外，有4条是和古菌存在序列相似性的未培养细菌。