Methylobacterium.sp MB200突变体库的构建及一碳代谢相关基因mtdA和mtdB的初步研究

摘要

甲基营养型细菌能够利用不含C-C键的化合物为唯一的能源和碳源,它们具有特殊的一碳代谢途径。此类细菌可用来生产单细胞蛋白和氨基酸等,具有广泛的商业价值。
　　 本研究所用的M.sp MB200是一株兼性的甲基营养菌,它能在以甲醇为唯一碳源的培养基上生长。为更好的研究了解其一碳同化的途径,我们利用pTnMod-RKm'构建了M.sp MB200的部分突变体库,共获得突变菌株11554株,经过进一步利用甲醇为唯一碳源的培养基复筛,最后筛选到333株不能利用甲醇的突变株。通过TAIL-PCR的方法我们对其中9株突变菌的转座子插入基因进行了初步定位,它们分别为丝氨酸乙醛酸氨基转移酶;亚甲基四氢甲烷蝶呤脱氢酶(mtdB);丁烯酰辅酶A还原酶;乙醇脱氢酶;亚甲基四氢叶酸脱氢酶(mtdA);血管性假性血友病因子蛋白A型:MxaA;苹果酸硫激酶和假定有机溶剂性蛋白。
　　 利用pTnMod-RKm'含有复制起始位点的优点迅速的克隆了基因mtdA和mtdB,并进行了初步的生物信息学分析,发现基因mtdA与M.populi BJ001的mtdA基因的一致性最高,达到95％。基因mtdB与M.extorquens DM4的mtdB基因的一致性最高,达到94％。
　　 通过与表达载体pCM80连接构建重组质粒,然后分别构建了这两个基因的互补菌和过量表达的重组菌,发现互补菌株能够重新利用甲醇作为唯一碳源生长。通过静息细胞发酵试验发现这两个基因过量表达的重组菌L-丝氨酸的产量较原始菌株分别提高了32.1％和27.0％。