十字花科黑腐病菌Ⅳ型分泌系统效应物基因的筛选和鉴定

摘要

十字花科黑腐病(Xanthomonascampestrispv.campestris，Xcc)是一种能在全球范围内引起所有十字花科植物黑腐病的重要病原细菌。在革兰氏阴性细菌中，存在六种主要的蛋白分泌系统参与大分子物质的分泌。其中Ⅳ型分泌系统(T4SS)对多种的动物及人体病原细菌的致病性起着重要的作用，而且在植物病原细菌根癌农杆菌的致病过程中扮演重要角色。在黄单胞菌属中，Xac有12个基因编码的蛋白与VirD4(Ⅳ型分泌系统ATPase)互作。基因组注释表明，Xcc8004含有编码T4SS的基因，其中10个基因(XC1630-XC1639)成簇存在。而且XC1630-XC1639的Tn5gusA5突变体的GUS活性平板检测显示，这10个基因在MMX培养基上明显比在NYGA培养基上表达强烈，表明T4SS是受信号诱导的。本研究旨在筛选和鉴定Ⅳ型分泌系统效应物，为阐明该系统的生理功能，作用机制奠定基础。
　　 首先以三个Xcc8004Ⅳ型分泌系统装置蛋白基因XC1632、XC1633和XC1637的Tn5gusA5突变体为报告系统，通过测定GUS的方法，检测了常用的六种培养基，结果显示XCM诱导效果最好。然后以XCM为基础，用多种常用碳源，氨基酸和TCA循环成分替换琥珀酸，结果没有发现更好的替代物。在XCM不同pH条件下进行GUS活性检测，显示pH7.0较好。此外，能诱导农杆菌Vir基因活化的乙酰丁香酮经检测对Xcc的T4SS无诱导效果。因此选定了XCMpH7.0作为诱导T4SS的培养基。
　　 其次在Xcc8004里搜寻与Xac的12个基因同源的基因，并从中挑选了4个：XC0066、XC2288、XC3660和XC4282作为研究对象。通过生物信息学分析，发现这4个基因编码的蛋白C端含有与Xac里报道相似的保守序列（GLxRIDHV和GxxDPAHxRAHV，x为任意残基），而且也都存在富含谷氨酰胺的尾巴。PCR扩增目标基因启动子加ORF去掉终止密码子片段，克隆到报告质粒pLGUS上，将获得的重组质粒三亲分别导入到Xcc8004和Xcc8004AT4SS，测定胞外GUS。结果显示通过该方法未能验证出这4个基因是Ⅳ型效应物基因。