猪瘟病毒感染对宿主细胞免疫应答基因的影响

摘要

猪瘟病毒(CSFV)是一种带有囊膜的单股正链RNA病毒，与牛病毒性粘膜腹泻病毒和羊边界病毒同属于黄病毒科瘟病毒属。猪瘟病毒的基因组大小约12.3 kb，只含有一个开放阅读框，编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，该多聚蛋白在宿主细胞蛋白酶和病毒特异的蛋白酶共同作用下裂解为4个结构蛋白和8个非结构蛋白。家猪和野猪是该病毒的唯一宿主，猪瘟病毒引起的猪瘟是一种具有高发病率和高死亡率的烈性接触性传染病，给养猪业造成巨大的经济损失，世界卫生组织OIE将其列为A类必须申报的重要动物传染病之一，我国也将猪瘟定为一类动物传染病，并从2008年起列为动物疫病强制免疫项目。
　　 随着猪瘟疫苗的广泛使用，改变了猪瘟病毒的生态环境，猪瘟在流行特点和发病特点上发生了很大的变化，由大流行转变为地方性流行或散发，临床症状从典型转变为非典型，出现母猪繁殖障碍和新生仔猪先天感染。从精液、睾丸、扁桃体和淋巴结中检测到猪瘟病毒的存在，甚至在部分免疫了的猪体内检出猪瘟病毒，证实了猪瘟病毒存在持续感染现象。病毒要实现潜伏或持续性感染，必需逃脱宿主免疫系统的监视，突破宿主抗病毒防卫机制而获得免疫逃逸。研究猪瘟病毒与宿主之间的相互作用关系是理解病毒致病机制及其免疫应答的基础，猪瘟病毒在宿主体内或体外对靶细胞的影响正是它们相互作用的具体表现。PK-15细胞是猪瘟病毒体外感染的主要传代细胞，探索猪瘟病毒对PK-15细胞功能的影响，将有助于揭示猪瘟病毒感染的致病机制。因此，在本研究中应用real-time RT-PCR和Western blot方法对CSFV感染后宿主细胞的免疫应答基因表达的变化进行了研究，主要结果如下:
　　 1.建立了检测猪免疫应答基因mRNA表达水平的real-time RT-PCR方法。
　　 根据已知的猪源SLA-2、TAP1、SLA-DR、Ii、CD40、CD80、CD86、IFN-α、IFN-β、GAPDH基因和CSFV5'UTR基因片段的mRNA序列，采用生物软件Oligo6.0和Primer5.0辅助设计并合成了11对特异性引物;以Oligo(dT)18为引物，合成第一链cDNA;以cDNA为模板，分别进行11个目的基因片段的PCR扩增;胶回收PCR产物，把它们克隆到pMD18-T载体上并测序;对提取的重组质粒进行10倍梯度稀释作为标准模板进行PCR扩增，同时对荧光定量PCR反应的引物浓度和退火温度进行优化。应用11对引物分别扩增出目的基因目的条带，大小与预期片段相符合;real-timeRT-PCR反应的最佳引物浓度是202.5 nmol/μl，最佳退火温度是60℃;目的基因real-time RT-PCR融解曲线均显示单一溶解峰。结果表明，本试验成功地建立了检测PK-15细胞中SLA-2、TAP1、SLA-DR、Ii、CD40、CD80、CD86、IFN-α、IFN-β、GAPDH和CSFV5'UTR基因mRNA表达动态的实时荧光定量PCR方法。
　　 2.应用real-time RT-PCR方法检测猪瘟病毒感染后不同时间段的PK-15细胞中免疫应答基因的mRNA转录情况。
　　 在自然和实验环境下，猪瘟病毒能逃避宿主的免疫系统建立持续性感染。猜测，与MHC和细胞因子调控有关的一些基因卷入到免疫逃避事件中，但是具体的每一个基因在感染了CSFV后有什么变化尚不清楚。因此，用不同感染量猪瘟病毒Shimen毒株和GXXJ01毒株分别感染PK-15细胞，感染后1、3、12、24、36和48 h应用real-time RT-PCR方法检测细胞中免疫应答基因SLA-2、TAP1、SLA-DR、Ii、CD40、CD80、CD86、IFN-α和IFN-β的mRNA表达动态。结果显示，SLA-2、TAP1、SLA-DR、Ii、CD40、CD80和CD86的mRNA表达呈现明显的下调，其中SLA-DR和Ii的mRNA下调特别显著，IFN-α和IFN-β的mRNA表达没有明显变化，表明CSFV可能参与了抑制免疫应答基因表达的机制。
　　 3.猪瘟病毒感染对宿主细胞中SLA-DR表达的影响。
　　 PK-15细胞感染猪瘟病毒Shimen毒株后，细胞内SLA-DR蛋白表达呈现明显的下调，在病毒感染后的24和36h检测不到SLA-DR蛋白，在感染后的48 h检测到少量的SLA-DR蛋白。为了探讨猪瘟病毒诱导的SLA-DR的分子机制，从猪瘟病毒Shimen毒株中扩增出C、Npro和E2基因，将其与真核表达载体pcDNA3.0连接，成功构建了P-C、P-Npro和P-E2重组真核表达质粒。构建成功的3个真核表达质粒应用脂质体介导的转染方法进行体外细胞表达，转染后的1、3、12、24、36和48 h检测细胞中SLA-DR的表达情况。结果显示，分别转染真核表达质粒P-E2和P-C后，PK-15细胞中SLA-DR的转录水平有所升高;转染真核表达质粒P-Npro后，PK-15细胞中SLA-DR的表达在3～24 h显示升高，24 h后开始下降，36 h后恢复到与对照组一致的水平;在蛋白质水平对PK-15细胞中SLA-DR蛋白表达进行了检测，发现分别转染或共转染P-C、P-E2和P-C/P-E2后，细胞中SLA-DR蛋白的表达有比较明显的提高;转染P-C/P-NPro/P-E2后，细胞中SLA-DR蛋白的表达量稍有上升;分别转染或共转染P-Npro、P-C/P-Npro、P-NPro/P-E2后，PK-15细胞中SLA-DR蛋白的表达明显下降。表明猪瘟病毒E2和C两个基因单独或协同作用对宿主细胞SLA-DR的下调表达没有显著影响，Npro基因对PK-15细胞中SLA-DR的表达有一定的抑制作用。研究认为，病毒病的发生、发展是多基因、多步骤、多阶段参与的过程，猪瘟病毒的不同基因在抑制宿主细胞SLA-DR表达过程中的作用有待于进一步研究。

目录

声明

摘要

前言

第一章 综述

第一节 猪瘟病毒研究进展

1．猪瘟的流行特点

2．猪瘟病毒的基因组结构及其编码蛋白的功能

3．猪瘟病毒的致病机制

第二节 病毒干扰MHC类分子抗原递呈的策略

1．MHC类分子及其分子伴侣和共刺激分子的结构和功能

2．病毒干扰MHC类分子抗原递呈的策略

第三节 real-time PCR分析mRNA表达水平方法的研究进展

1．背景介绍

2．Real-time PCR技术的特点

3．Real-time PCR技术的应用

第四节 本研究的目的及意义

第二章 实时荧光定量PCR检测猪瘟病毒感染宿主细胞免疫应答基因方法的建立和应用

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果

2．1 引物特异性检测结果

2．2 重组质粒目的基因测序结果

2．3 Real—time PCR反应条件优化结果

2．4目的基因real-time PCR标准曲线构建的结果

2．5 Real-time PCR最适读板温度的确定

2．6 猪瘟病毒Shimen毒株、GXXJ01毒株和新城疫病毒效价测定

2．7 新城疫病毒感染后PK-15细胞中IFN-α和IFN-β mRNA的转录动态

2．8 Po|y|∶C转染后PK-15细胞中IFN-α和IFN-β mRNA的转录动态

2．9 猪瘟病毒感染后PK-15细胞中部分免疫应答基因mRNA转录动态

3．讨论

4．小结

第三章 猪瘟病毒感染对PK-15细胞中SLA-DR表达的影响

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果

2．1 猪瘟病毒C、Npro和E2基因的克隆与鉴定

2．2 重组质粒T-C、T-Npro和T-E2的测序及同源性分析

2．3 猪瘟病毒c、Npro和E2基因真核表达质粒的构建

2．4 猪瘟病毒感染对PK-15细胞中SLA-DR表达的影响

2．5 猪瘟病毒Shimen毒株C蛋白对宿主细胞中SLA-DR表达的影响

2．6 猪瘟病毒Shimen毒株Npro蛋白对宿主细胞中SLA-DR表达的影响

2．7 猪瘟病毒Shimen毒株E2蛋白对宿主细胞中SLA-DR表达的影响

2．8 猪瘟病毒C和Npro蛋白对宿主细胞中SLA-DR表达的影响

2．9猪瘟病毒Shimen毒株C和E2蛋白对宿主细胞中SLA-DR表达的影响

2．10 猪瘟病毒Shimen毒株Npro和E2蛋白对宿主细胞中SLA-DR表达的影响

2．11 猪瘟病毒Shimen毒株C、Npro和E2蛋白对宿主细胞中SLA-DR表达的影响

3．讨论

4．小结

第四章 全文结论

第五章 展望

参考文献

附录一

附录二

致谢

攻读学位期间发表的学术论文