影响水牛精子分离和冷冻后精子质量相关因素的研究

摘要

性别控制技术可以推动家畜育种进程和加快繁殖人们所期望的性别后代。尽管分离水牛X和Y精子性别控制技术体系已经建立，但分离精子用于体外受精后的囊胚发育率和人工授精后的受胎率仍低于未分离精子。精子分离及冷冻过程伴随着精液的高倍稀释、精子核染色、紫外激光照射和冷冻保存等处理程序，这些程序可能对精子的活力、质膜完整性、顶体完整性、线粒体膜电位、DNA完整性和凋亡等产生影响。本研究探讨了水牛精子分离及冷冻程序不同处理对（新鲜、染色、分离和冷冻）精子细胞器的损伤，旨在优化水牛精子分离及冷冻程序，以期提高分离精子的质量，为水牛品种改良提供有力的技术保障。具体研究内容包括以下几个部分:
　　 1.探讨水牛精子分离过程中不同处理（新鲜、染色、分离和冷冻）精子的活力、质膜完整性、凋亡和DNA完整性的变化。结果表明，分离组和冷冻组的精子活力比新鲜组和染色组低(54.72％，52.38％ vs.98.07％，96.41％，P＜0.05)。荧光显微镜法和流式细胞仪法检测精子质膜完整性的试验结果均表明，新鲜组、染色组和分离组的精子质膜完整率差异不显著(P＞0.05)，但均显著高于冷冻组(72.12％，69.39％，77.26％ vs.58.45％;64.74％,63.69％，66.25％ vs.36.98％，P＜0.05)。精子凋亡方面，荧光显微镜法和流式细胞仪法检测的试验结果均表明，新鲜组的凋亡率最低，显著低于分离组和冷冻组(8.11％ vs.13.23％，18.74％;7.56％ vs.12.86％，22.4％， P＜0.05）。精子染色质扩散试验(SCD)和精子染色质结构分析法(SCSA)检测精子DNA损伤率的试验结果均表明，分离组精子的DNA损伤率最低，显著低于新鲜组、染色组和冷冻组(0.47％ vs.2.23％，2.25％，2.26％;0.51％vs.2.55％,2.64％,2.15％, P＜0.05)。
　　 2.研究冷冻保存的不同公牛个体分离精子与未分离精子的活力、质膜完整性、凋亡和DNA完整性的变化。精子图像分析仪检测结果表明，3头尼里拉菲水牛分离精子的活力均显著低于未分离精子，分别为38.9％ vs.59.6％;35.8％ vs.58.1％;34％ vs.59.1％(P＜0.05)。染色质结构分析法检测结果表明，3头尼里拉菲水牛分离精子的DNA损伤率均比未分离精子低（1.86％ vs.2.47％，2.05％ vs.3.0％，3.45 vs.4.38％，P＜0.05），其中3号公牛分离精子和未分离精子的DNA损伤率均高于其它两头公牛。荧光显微镜法检测结果表明，3头尼里拉菲水牛分离精子的质膜完整率均比未分离精子高（55.3％ vs.42.4％，52.7％ vs.41.7％，51.6％ vs.43.3％，P＜0.05）。荧光显微镜法检测结果表明，3头尼里拉菲水牛分离精子的凋亡率均比未分离精子高（28.3％ vs.21.1％，31.5％ vs.23.6％，32％ vs.23％，P＜0.05），其中3号公牛分离精子的凋亡率高于其它两头公牛。
　　 3.研究水牛精子分离及冷冻程序各稀释液（染色液、收集液和冷冻液）中添加叶酸或谷胱甘肽对精子的活力、质膜完整性、凋亡和DNA完整性的影响。试验结果表明，在水牛精子分离及冷冻程序各稀释液（染色液、收集液和冷冻液）中添加叶酸或谷胱甘肽后精子的活力、质膜完整性和DNA损伤率与对照组相比差异不显著(P＞0.05)。在冷冻液中添加叶酸或谷胱甘肽后均显著降低了精子凋亡率(P＜0.05)。
　　 4.本研究旨在建立激光光镊拉曼光谱技术检测水牛分离精子的试验平台。水牛精子分离及冷冻程序不同处理的精子（新鲜、染色、分离和冷冻）拉曼光谱检测结果表明，与新鲜组相比，代表磷酸骨架(O-P-O)的788 cm-1在分离组和冷冻组分别位移到783 cm-1和785 cm-1，代表脱氧核糖C-O伸缩振动的1010 cm-1在染色组、分离组和冷冻组分别位移到1004 cm-1、1005 cm-1和1005 cm-1。水牛精子分离及冷冻程序不同处理的精子（新鲜、染色、分离和冷冻）原始拉曼光谱经标准化处理后，主成分分析的试验结果表明，可以有效的将不同处理组的精子分开。
　　 5.研究在水牛分离精子的染色液、收集液和冷冻液中分别添加叶酸或谷胱甘肽后对精子拉曼光谱的影响。结果表明:(1)代表脱氧核糖振动的谱线从新鲜组的1010 cm-1位移到染色组的1004 cm-1，在染色液中分别添加叶酸或谷胱甘肽后从对照组的1004 cm-1分别位移到1008 cm-1（叶酸）和1005 cm-1（谷胱甘肽），冷冻液中分别添加叶酸或谷胱甘肽后从对照组的1004 cm-1分别位移到1008 cm-1（叶酸）和1010cm-1（谷胱甘肽）。代表碱基谱线信息的682 cm-1、1341 cm-1、1379 cm-1和1557 cm-1等也存在不同程度的位移。而分别在染色液、收集液和冷冻液中添加叶酸或谷胱甘肽后，代表磷酸骨架(O-P-O)的788 cm-1及代表O=P=O对称伸缩振动的1094 cm-1仅出现了特征峰强度的不同。(2)在水牛精子分离及冷冻程序的染色液、收集液和冷冻液中添加叶酸或谷胱甘肽后的拉曼光谱与对照组的差异谱线中发现了代表过氧化氢的880 cm-1的存在。(3)对分离精子的拉曼光谱进行标注化处理后，主成分分析法可以对不同精子处理组进行识别和判断。
　　 6.本研究探讨(1)不同公牛个体分离精子和未分离精子体外受精后胚胎的发育能力;(2)X精子和Y精子体外受精后的胚胎发育能力(3)精子分离及冷冻程序各稀释液中添加抗氧化剂（叶酸或谷胱甘肽）对胚胎发育的影响。结果表明:(1)3头尼里拉菲水牛分离精子体外受精后的囊胚发育率均显著低于未分离精子，分别为11.6％ vs.21.8％，11.9％ vs.22.6％，9.2％ vs.16.4％(P＜0.05)。(2)X精子和Y精子体外受精后的分裂率、囊胚率及囊胚发育速度的差异均不显著(P＞0.05)。(3)在分离及冷冻程序各稀释液中添加叶酸后分离精子体外受精后的分裂率和囊胚率与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，而在精子分离及冷冻程序各稀释液中添加谷胱甘肽后分离精子体外受精后的囊胚率显著高于对照组(P＜0.05)。
　　 7.研究水牛精子分离及冷冻程序各稀释液（染色液、分离液和冷冻液）中分别添加叶酸或谷胱甘肽后对分离精子人工授精受胎率的影响。结果表明:(1)在精子分离及冷冻程序各稀释液中添加叶酸后分离精子人工授精后的受胎率与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，但流产率显著低于对照组(P＜0.05)。(2)在精子分离及冷冻程序各稀释液中添加谷胱甘肽后分离精子人工授精后的受胎率显著高于对照组(P＜0.05)，但流产率与对照组相比差异不显著(P＞0.05)。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

一、分离精子的发展简史及几种分离精子的方法

二、影响分离精子质量的因素

三、哺乳动物X和Y精子分离的研究概况

四、精子质量指标的研究概况

五、活性氧对精子质量的影响

六、谷胱甘肽(GSH)和叶酸(folic acid)在精液冷冻保存中的应用

七、激光拉曼光谱

八、分离精子体外受精

九、分离精子人工授精(artificial insemination，AI)

第二章 水牛精子质量指标的检测

第一节 水牛X和Y精子分离及冷冻程序对精子质量指标的影响

1 材料方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第二节 冷冻保存的水牛分离精子和未分离精子质量指标的检测

1 材料方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第三节 水牛分离精子染色液、收集液和冷冻液中添加叶酸或谷胱甘肽(GSH)对精子质量的影响

1 材料方法

2 试验结果

3．讨论

4 小结

第三章 水牛分离精子激光拉曼光谱平台的建立

第一节 激光拉曼光谱在水牛分离精子质量检测体系中的应用

1 材料方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第二节 水牛分离精子染色液、收集液和冷冻液中添加叶酸或谷胱甘肽对水牛精子头部拉曼光谱的影响

1 材料方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第四章 水牛分离精子的体外受精和人工授精

第一节 水牛分离精子的体外受精

1 材料方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第二节 水牛分离精子的人工授精

1 材料方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

总结论

附录

参考文献

致谢