大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)对罗非鱼链球菌口服疫苗免疫增强效果的初步研究

摘要

口服免疫是一种简单而有效诱导粘膜免疫的免疫方式，但由于缺乏良好的运输系统和吸收系统，很大程度上限制了口服疫苗的发展。大肠毒素不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是一个强有力的调节免疫的信号和载体分子，因而通常被作为佐剂应用于口服疫苗。为了研究LTB对罗非鱼链球菌口服疫苗的免疫增强效果，本研究通过对已构建的LTB重组酵母进行诱导表达，探索重组LTB最佳表达时间并检测其安全性，并建立罗非鱼抗体检测间接ELISA方法，为罗非鱼抗体的检测奠定了基础，最后将LTB与链球菌口服疫苗联合口服免疫罗非鱼，研究LTB对罗非鱼的免疫增强效果，为链球菌口服疫苗免疫佐剂开发利用提供数据参考。
　　 本实验通过对已构建的重组LTB KM71毕赤酵母进行诱导表达以及LTB毒性实验，探讨重组LTB的最佳表达时间以及表达量，检测了LTB对罗非鱼的安全性。实验显示，重组LTB在毕赤酵母中得到有效表达，最佳的表达时间为96h，表达量为2.716mg/mL。LTB对罗非鱼在灌胃初期具有轻微刺激性，但能够作为罗非鱼肠道粘膜佐剂使用。在罗非鱼血清及粘膜抗体水平间接ELISA检测方法建立的实验中发现，罗非鱼血清抗体间接ELISA检测的最佳反应温度为22℃，抗原包被浓度为5.5μg/mL，待测血清、多抗的稀释度和酶标二抗的稀释度分别为1/400、1/2000和1/8000。
　　 在对LTB的免疫增强效果研究的试验中，以罗非鱼链球菌口服疫苗0.2×109cells/尾、0.2×108 cells/尾和0.2×107cells/尾三个口服剂量水平以及LTB口服剂量1.68μg/尾、0.84μg/尾和0.17μg/尾3个处理水平设计联合疫苗，并通过口服免疫罗非鱼，评价LTB的免疫增强效果及联合疫苗相对保护率。结果表明，LTB能够促进血清以及肠道粘膜抗体水平，对链球菌口服疫苗有佐剂效应。当疫苗口服剂量为0.2×108cells/尾，LTB口服剂量为0.84μg/尾的组合时达到最佳免疫效果，该组合能在免疫后期稳定持续高效的提高血清和肠道粘膜抗体应答水平，并且使罗非鱼在免疫后第10d、20d和30d相对保护率分别达到65.00％、68.42％和64.71％。肠道粘膜抗体水平和LTB的含量成正比，但在免疫期内同—LTB含量实验组的抗体水平波动幅度较大。检测LTB对罗非鱼非特异性免疫效应的影响，发现LTB可显著提高溶菌酶和碱性磷酸酶水平，对酸性磷酸酶无显著影响，但对超氧化物歧化酶表现出抑制作用。
　　 实验结果表明，LTB虽然对罗非鱼灌胃前期具有微弱刺激性，但总体可提高鱼体的免疫力，与罗非鱼链球菌口服疫苗联合时，可明显提高50g～60g罗非鱼链球菌口服疫苗的免疫效果，提高血清和肠道粘膜免疫水平，是一种具有潜力的口服疫苗免疫佐剂。

目录

声明

摘要

符号说明

1 前言

1．1 口服疫苗的研究进展

1．1．1 人用口服疫苗的研究进展

1．1．2 兽用口服疫苗的研究进展

1．1．3 水产口服免疫研究进展

1．2 水产口服免疫佐剂

1．2．1 口服疫苗免疫佐剂作用机理

1．2．2 几种主要的水产口服免疫佐剂

1．2．2 细胞因子

1．2．3 其他口服免疫佐剂

1．3 LTB的研究进展

1．3．1 LT的结构和组成

1．3．2 LT的免疫原性及机理

1．3．3 LTB的佐剂作用

1．4 研究的目的及意义

2 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达纯化及其毒性研究

2．1 材料

2．1．1 细菌

2．1．2 实验动物

2．1．3 主要仪器

2．1．4 主要试剂及材料

2．1．5 主要试剂及培养基的配置

2．2 实验方法

2．2．1 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达纯化

2．2．2 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的毒性研究

2．3 结果

2．3．1 重组LTB蛋白的最佳表达时间

2．3．2 重组LTB的纯化浓缩结果

2．3．3 LTB的毒性

2．4 讨论

2．4．1 LTB的表达

2．4．2 LTB的毒性

3 罗非鱼抗体检测间接ELISA方法的建立

3．1 材料

3．1．1 实验鱼

3．1．2 细菌

3．1．3 疫苗

3．1．4 主要仪器

3．1．5 主要试剂及材料

3．1．6 主要溶液的配置

3．2 方法

3．2．1 罗非鱼IgM的纯化及多克隆抗体的制备

3．2．2 罗非鱼抗体间接ELISA方法的建立

3．3 实验结果

3．3．1 提纯后IgM的浓度

3．3．2 罗非鱼提纯IgM SDS-PAGE电泳以及Westen Blotting结果

3．3．3 抗原浓度测定结果

3．3．4 最适反应温度

3．3．5 抗原最适包被时间

3．3．6 抗原及待测血清浓度的最佳稀释度

3．3．7 兔抗罗非鱼及酶标二抗的最佳稀释度

3．3．8 粘膜抗体检测抗体检测条件的优化

3．3．9 最终ELISA优化结果

3．4 讨论

3．4．1 关于罗非鱼IgM的提纯

3．4．2 ELISA方法的建立

4 LTB对罗非鱼链球菌疫苗的免疫增强效应研究

4．1 材料

4．1．1 实验鱼

4．1．2 LTB

4．1．3 联合疫苗的制作

4．1．4 细菌

4．1．5 实验试剂

4．2 方法

4．2．1 罗非鱼的免疫

4．2．2 免疫保护率的检测

4．2．3 血清及粘膜抗体采集及检测

4．2．4 血清非特异性免疫指标检测

4．2．5 数据分析

4．3 结果

4．3．1 免疫保护率结果

4．3．2 血清抗体检测结果

4．3．3 肠道粘膜抗体检测结果

4．3．4 溶菌酶活力检测结果

4．3．5 LTB对超氧化物歧化酶(SOD)的影响

4．3．6 LTB对酸性磷酸酶(ACP)的影响

4．3．7 LTB对碱性磷酸酶(AKP)的影响

4．4 讨论

4．4．1 LTB的佐剂活性

4．3．2 关于LTB的非特异性免疫效应研究

5 结论

参考文献

致谢

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